工业微生物学课件---第八章 微生物遗传及诱变育种.pptVIP

微生物特异性平板检测方法 几种常用菌种保藏方法的比较 培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解 在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性 在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感 菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 原生质体制备的其他因素： 一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性 原生质体融合 聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合 一般PEG的使用浓度范围在25-40% 采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合 原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构 不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压 再生率 细菌为3-10% 真菌在20-80% 融合重组子的筛选 通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B- 重组子的检出方法有两种： 直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。 融合重组的频率 = 融合重组子 两亲株原生质体再生菌落的总数 2、杂交育种 进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等 许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示 妨碍了杂交育种手段的实际应用 3、基因工程 这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。 基因工程的应用仍有很大的局限性： 基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质 蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证 基因工程（包括代谢工程）还难以完全取代传统的菌种选育方法 一、菌种的衰退与复壮的概念 1.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变，②分离现象。 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 菌种的衰退、复壮及保藏 2、 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种 菌种的复壮措施：①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。④采用有效的菌种保藏方法。 * * * * （2) 5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物 机理： 与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应 酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似 ，与A配对 5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构 烯醇式5-BU不与A而与G配对 A：T?G：C 参数：浓度、时间、缓冲液 (3)诱变育种的基本过程如下： 出发菌株的选择 一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。 自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 菌株来源 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。 制备菌悬液 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。 一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。 产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢 菌悬液的细胞浓度一般控制为： 真菌孢子或酵母细胞106?107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。 诱