PCR引物设计软件Oligo60的使用方法.docVIP

PAGE PCR引物设计软件Oligo6.0的使用方法 一、前言 在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片断作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。 二、引物设计的原则 引物设计有几条基本原则： 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，ΔG值，引物二聚体及发夹结构，错误引发位点，引物及产物GC含量，有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，大致有以下的要点： 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃ 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃ ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（Δ 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 但由于各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。 三、引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。、自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。 四、Oligo 6的使用图解 1.功能简介 在专门的引物设计软件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图，。其实Oligo的主要功能集中在Analyze菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了。它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改进有，多序列共用引物设计，排除出现频率高的序列片断，搜索功能更加强大细致，改观了界面等等。使用Oligo自动搜索引物也未尝不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高。 2.使用方法 （1）打开oligo的页面如下： （2）单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口： （3）在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”： ? （4）选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”：? （5）出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”：? HYPERLINK /uploads/allimg/091123/201109D38-4.gif \t _blank 图中显示的三个指标为Tm，ΔG，Frq，其中Frq为6.22的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Fr