体外成熟与体外受精模式对猪卵成熟受精与胚发育之影响.DOCVIP

體外成熟與體外受精模式對豬卵成熟、受精與胚發育之影響 Effects of in vitro maturation and fertilization models on porcine oocyte maturation, fertilization and embryo development 研究生：蔡宜庭 Yi-Ting Tsai 指導教授：許岩得 Yan-Der Hsuuw 【摘要】 本研究之目的為降低豬卵母細胞體外受精過程中之多精入卵現象，並評估多精入卵對豬早期胚發育之影響。試驗所需之卵巢係取自屏東縣肉品市場之屠宰女豬，將其濾泡以解剖刀片劃破後收集卵丘-卵母細胞複合體（cumulus-oocyte complexs, COCs）作為主要材料。促進COCs成熟方面，於含有10%豬濾泡液環境之下，COCs以雌性素（0.5或1.0 μg/mL）與/或半胱胺酸（0.825 mM）預培養24小時。隨後評估COCs之生發泡（germinal vesicle, GV）瓦解與成熟之影響。結果顯示，COCs以雌性素或半胱胺酸進行預培養24小時，雖確能有效延長豬卵母細胞GV階段，但對後續成熟有不利之影響（P 0.05）。上皮細胞生長因子（epidermal growth factor, EGF）對豬胚發育影響試驗中，卵母細胞培養於含有EGF（10 ng/mL）之體外成熟培養液中44小時。結果顯示，於成熟培養液中添加EGF對豬卵母細胞成熟、受精、卵裂與囊胚形成皆無顯著影響。降低豬受精卵多精入卵現象方面，卵母細胞以不同受精模式進行受精作用，包括有大容量（30-50顆卵母細胞培養於2 mL受精培養液，精子濃度107與106 cells/mL），懸滴（10顆卵母細胞培養於10 μL培養液，精子濃度107、5×106、106、105、104 cells/mL）與麥管（精子濃度107與106 cells/mL）受精模式。結果顯示，使用懸滴培養模式並降低精子濃度雖造成精子穿透率下降且囊胚形成率較低，卻能有效提升單精入卵率（P 0.05）。此外，亦評估腺苷酸（10 μM）對卵母細胞受精作用之影響。結果顯示，使用腺苷酸替代咖啡因作為精子受精作用刺激劑，確能提升卵母細胞單精入卵率（P 0.05），而對其後續發育能力則無顯著影響。最後，以形態學評估多精入卵對豬胚後續發育之影響。2個、3個或3個以上原核之受精卵以離心方式確定。結果顯示，含有超過3個原核之受精卵其發育至8細胞階段之比率顯著低於含有2個與3個原核之受精卵（P 0.05）。綜合本研究之結果，於含有10%豬濾泡液環境之下，以E2或cysteine進行COCs預培養，皆無法改善其品質，且於IVM時添加EGF亦無法促進囊胚形成。使用懸滴培養模式並降低精子濃度雖造成精子穿透率下降，卻能有效提升單精入卵率。此外，超過3個原核之受精卵，其胚發育受阻於8-cell階段。 關鍵字：豬、多精入卵、囊胚 【Abstract】 Objectives of this study were to reduce the incidence of polyspermy in porcine zygotes in vitro, and evaluated effects of polyspermy on the development of porcine embryo in vitro. Ovaries were obtained from gilts at the Ping Tung slaughterhouse. Immature cumulus-oocyte complexes (COCs) used in all studies was received from follicles with a diameter of 3-6 mm by scalpel. In order to enhance the COCs maturation, COCs in the presence of 10% pFF were preincubated with E2 (0.5 or 1.0 μg/mL) and/or cysteine (0.825 mM) for 24 hr. The germinal vesicle (GV) breakdown, a process of meiosis, and maturation of COCs were estimated. Results showed that COCs preincubated either with E2 or cysteine exert a longer GV stage, and those oocytes have poor ability int