HPLC法测定复方氨基酸注射液 (18AA)中氨基酸含量.doc

PAGE PAGE 6 HPLC法测定复方氨基酸注射液 (18AA)中氨基酸含量 鲍恩泉（巢湖市药品检验所 巢湖 238000） 摘要 目的：建立HPLC法测定复方氨基酸注射液（18AA）中各种氨基酸含量方法及测定厂家18AA制剂中氨基酸的含量。 方法：氨基酸采用柱前衍生后用HPLC法测定；色谱柱：Agela Technologies C18(4.6mm×250 mm，5μm)；流动相：A相：1mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH至6.0），B相：50%乙腈；梯度洗脱；流速:1.0 ml·min-1；检测波长:360 nm；柱温：27℃；进样量：20 μl。结果与结论：各种氨基酸的线性、稳定性、重复性和准确性均符合方法学要求。 关键词：HPLC；复方氨基酸注射液（18AA）；梯度洗脱；含量测定 复方氨基酸注射液(18AA)是一种复方氨基酸注射液 ，它们是构成蛋白质的主要成分，在医学上广泛用于治疗各种疾病 ，特别是复方氨基酸注射液作为营养药品，应用日益广泛。其氨基酸种类多；必需氨基酸含量高；支链氨基酸含量丰富；含一定量胱氨酸、酪氨酸及较高含量的精氨酸；我们建立了一种柱前衍生化后利用HPLC法测定复方氨基酸注射液(18AA)中各种氨基酸含量的测定方法，选用了新的流动相成分和比例，对影响分离的诸因素做优化试验。通过试验，明确了各因素对不同的氨基酸保留时间的影响，优选出了最佳分离条件，使得各氨基酸的分离度符合要求、重现性稳定，定量结果令人满意。 1 实验材料 1.1 供试品 安徽丰原药业股份有限公司,复方氨基酸注射液（18AA）3批,批号090828211.2 仪器 Agilent 1200全自动进样高效液相色谱仪；梅特勒-托利多AL204电子天平；Jl-120超声波清洗器。 1.2 试剂 氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：140624-200805）；乙腈为进口色谱纯；水为重蒸馏水；其他化学试剂均为分析纯；2，4一二硝基氟苯(DNFB)为生化试剂(经减压重蒸馏)。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Agela Technologies C18(4.6mm×250 mm，5μm)；流动相A相：1mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH至6.0）B相：50%乙腈；梯度洗脱:见表1；流速:1.0 ml·min-1；检测波长：360nm；进样量：20μl；柱温：27℃。 表1 梯度洗脱表 序号 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 1 0.00 71.0 29.0 2 5.00 65.0 35.0 3 10.00 57.0 43.0 4 11.00 51.0 49.0 5 15.00 45.0 55.0 6 20.00 35.0 65.0 7 25.00 25.0 75.0 8 30.00 2.0 98.0 9 35.00 2.0 98.0 10 36.00 60.0 40.0 11 37.00 60.0 40.0 12 44.00 71.0 29.0 2.2 供试样品和对照品及空白溶液的制备 对照品溶液的制备 按样品处方配置，精密称取对照品适量，加水适量超声溶解。再精密量取1ml置10ml量瓶中，依次加入0.05mol/l的碳酸氢钠溶液1ml和1%2-4二硝基氟苯1ml，放入60℃水浴中1小时，取出，冷却置室温，再用水稀释至刻度，摇匀。作为对照品溶液，进样前用0.45μm微孔滤膜过滤。 供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，分别置200ml量瓶中，充分摇匀，再精密量取1ml置10ml量瓶中，依次加入0.05mol/l的碳酸氢钠溶液1ml和1%2-4二硝基氟苯1ml，放入60℃水浴中1小时，取出，冷却置室温，再用水稀释至刻度，摇匀。作为供试品溶液，进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤。 空白溶液的制备 按处方称取除氨基酸外其它组分，按供试品溶液制备方法制备，作为空白溶液。 3. 结果 3.1 辅料与衍生化试剂的干扰 分别吸取对照品溶液、供试品溶液及空白溶液20 μl在HPLC上进样分析，记录色谱图，见图1。各成分分离均符合要求，各氨基酸的理论板数均大于30000，阴性样品供试液无干扰。 A B C 图1.氨基酸对照品（A），供试品（B），空白（C）的色谱图 3.2标准曲线的制备 吸取“2.2”项下对照品溶液，5μl、10μl、20μl、50μl、100μl分别进样分析，记录色谱图。以峰面积y对进样量x (μg)进行线性回归得各种氨基酸的线性回归方程，由结果可见各氨基酸在含量测定浓度范围内，蜂面积与进样量呈良好线性关系，线性回归方程表见表2。 表2 线性回归方程 序号 氨基酸名称