血清清蛋白的分离、纯化和鉴定.pptVIP

淀粉酶活性的测定 一、实验目的 掌握测定淀粉酶活性的原理 熟悉测定淀粉酶活性操作方法 方法一：3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性 一、实验目的 1. 掌握用3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性的方法 2. 熟悉3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性的原理 二、基本原理 1、测量依据 淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键水解,产生还原糖淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比，可以单位体积样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。 2、相关反应: ：淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。具体反应式为： 三、操作步骤 实验设备 试管，滴管，容量瓶，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，电磁炉。 1. 实验设备： 三、操作步骤 （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。 （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液； 实验试剂及其配制： （3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入； 麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中； （5）pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。 （6）0.4mol/L的NaOH溶液； （7）淀粉酶溶液 三、操作步骤 实验步骤 淀粉酶活力测定 (1)取试管： 取试管4支,2支为对照管,2支为测定管。(2) 装溶液：在2支对照管中分别加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (3) 加试剂：在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液和淀粉酶溶液lml。 基本操作 (4) 保温：将4支试管置另一个37℃ 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入37℃下预热的1％淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入37℃恒温水浴保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。 麦芽糖的测定 ： (1)标准曲线的制作: 取试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml ）0,0.2,0.6, 1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热10min，取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（ mg ）为横坐标，绘制标准曲线 ② （操作的关键环节） 样品的测定: 取酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂。置沸水浴中加热10min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。 计算公式： 相关实验 一、实验拓展 方法二：碘-淀粉测定淀粉酶活性 一、实验目的 掌握测定淀粉酶活性的原理 熟悉测定淀粉酶活性操作方法 二、基本原理 原理：淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及糊精。利用已知浓度的淀粉溶液作为底物，加入一定量的淀粉酶，在适应条件下淀粉酶将部分淀粉水解。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与淀粉的浓度成正相关,用分光光度计法测出反应后淀粉的浓度，从而推算出单位体积样品在一定时间内消耗淀粉的量。 ? 五、讨论 依据血清电泳的结果作为阳性对照，判断盐析过滤液中有无清蛋白。 ② 分析所获得的清蛋白纯度 ① 分析有无分离获得清蛋白 根据层析液样品电泳结果中杂蛋白条带出现的情况，判断分离的清蛋白纯度。 六、结论