抗氧化酶活性等测定方法.docVIP

PAGE PAGE 6 叶绿体的提取 一、试剂配置 1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）; 2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）； 3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水； 实际配制： PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）; 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml） 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加） 2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎） 3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成； 4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物； 5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做) 8、用Percol试剂进行梯度离心（将3ml含有80%Percol（原液按100%算）铺在10ml离心管下层，再把3ml 40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g 2-3min（用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1），下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体; 9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml-1；（计算：取叶绿体悬浮液0.1ml，加4.9 ml 80%的丙酮，摇匀后于1000g离心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式计算：OD625nm×50/34.5=叶绿素mg/ml） 10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%； 参考：Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018. 取上述制备的完整叶绿体进行如下测定： 用50mM PBS（保护酶或其他测定项目的缓冲液）稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX； 用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定H2O2；（本试验中用0.2 mol/L HClO4稀释） 用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA； 用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素； 抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2