NK细胞毒检测NK细胞活性检测自然杀伤细胞NK.PPTVIP

王迪 Dec. 26, 2013 Email: jluwangdi@jlu.edu.cn NK细胞毒检测 NK细胞活性检测 自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生发展。 NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。 增强免疫力功能相关的保健食品申报过程中，NK细胞活性检测是其中的重要指标。 主 要 内 容 实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定 实验分组及材料 器材 75%酒精 若干 5ml注射器 1个/组 100ml烧杯 1个/组 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小） 3盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 无菌离心筒 1个/组 可调微量加样器 1套/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 1套/ 组 细胞培养箱 1台/room 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 1台/组 动物、细胞及试剂 小鼠 1只/组 (NS,OVA) YAC-1 1*106*2ml 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组 培养液(DMEM) 10%FCS 10ml/组 LDH底物 3ml/组 柠檬酸（终止液） 1ml/组 分组： 每组4人 1只小鼠 原 理 NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 通过杀伤激活受体（KAR）直接识别 通过抗体间接识别：ADCC 分泌杀伤介质： perforin granzyme （TNF、IFN） 清除异常细胞 （肿瘤、病原体感染） NK细胞功能：清除异常细胞 通过杀伤激活受体（KAR）直接识别 通过抗体间接识别：ADCC NK细胞+靶细胞 靶细胞破裂,释放内容物 胞浆内酶类 LDH酶活性 胞浆内蛋白 放射性铬酸钠 51Cr标记 DNA 3H-TdR掺入 NK细胞活性检测 NK细胞分离方法 密度梯度离心 Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心 磁化细胞分离器分离法 常用的检测方法 同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 　　 乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用) 同位素释放法 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)，即可计算出NK细胞毒活性。 G0 G1 S Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR New DNA Or Protein cpm 乳酸脱氢酶释放法-原理 乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。 靶细胞 YAC-1 NK 杀伤 LDH 释放到细胞外 无色底物 LDH底物 还 原 有色物质 测OD570值 靶细胞 膜损伤 最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值 杀伤率( %)= Max- S自发 实验值-自