第十章节 基因工程技术育种.pptVIP

根据目前研究现状和发展趋势，海水鱼类基因工程的研究内容主要为： 分离和克隆海水鱼类中的有用基因; 筛选适用海水鱼类基因克隆和表达的载体及表达体系。 利用转基因技术，将外源基因导入海水鱼中，培育性状优良的转基因海水鱼类品系。 1. 海水鱼类基因的分离和克隆 基因的分离包括构建基因文库和从基因文库中筛选分离目的基因两大步骤。 几种重要的海水鱼类基因 生长激素基因 抗冻蛋白基因 催乳素基因和生长催乳素基因 抗冻蛋白基因 大多数海水鱼类的血清在-0.6 ℃即冻结，因此无法在温度过低的海域中生存，但仍有一些海水鱼类可以生存在这些严寒海域中。 早在1957年，Scholander等人首次观察和研究了这些鱼类的抗冻特性。他们发现在北极海水鱼的血清中存在一种生物大分子，它们起着降低血清凝固点的作用。 此后，DeVries等人从南极鱼血清中分离和分析了这种生物大分子，发现它们是一类有特殊化学结构的糖蛋白，称为抗冻糖蛋白（AFGP）。 上世纪80年代，加拿大Choy 等人发现了另一类抗冻蛋白。他们从产自北大西洋沿岸海域的美洲大绵鳚、冬鲽和杜父鱼中分离出3种类型的抗冻蛋白（AFP）。当AFP增至一定浓度，可以完全抑制冰晶的形成，因此即使在低于-1.7℃的低温条件下，含有一定浓度AFP的血清也不会冻结，这就是极地和北大西洋海域的海水鱼能够在严寒海水中生存的原因。 用这几种抗冻蛋白基因构建的各种表达重组体已经成功地应用于转抗冻蛋白基因鱼类的研究和基因工程菌表达生产抗冻蛋白的应用研究。 2. 海水鱼类的基因转移 在海水鱼类基因工程育种研究方面，目前所开展的工作主要是应用转基因技术将外源目的基因导入受体鱼类的生殖系细胞内，使之整合于受体细胞的染色体中，通过改变受体鱼遗传物质组成的方式达到培育优良性状的新品种的目的。 鱼类转基因技术研究始于淡水鱼。1985年，我国学者朱作言等人首次报道了转基因鱼试验成功。他们将小鼠金属硫蛋白启动子-人生长激素基因组体（mMT-hGH）导入金鱼受精卵中，获得了第一批转基因鱼。海水鱼类的转基因研究直到90年代初才有报道，加拿大研究者成功地将海水鱼的生长激素基因和抗冻蛋白基因导入鲑科鱼类，培育出个体较对照鱼30倍的“超级鱼”和能够表达抗冻蛋白的转基因大西洋鲑。我国 研究者在世纪初也将海水鱼生长激素成 功导入我国重要的海水经济鱼类真鲷和 牙鲆，培育出生长速度明显加快的转基 因海鱼群体。 鱼类作为转基因研究的实验动物，比哺乳动物等具有更多的优点： 鱼类怀卵量大，一次可产几万个至几十万个； 大多数种鱼类的卵子卵径大，卵质透明，便于进行显微注射等遗传操作； 鱼类是体外受精体外发育，易于进行人工受精和控制胚胎发育的条件。 2.1.显微注射法 显微注射法是目前最常用的方法，导入外源基因的成功率也比较高。主要包括两种方式： (1)卵母细胞的细胞核注射； (2)受精卵的细胞质注射。 显微注射法的优点是外源基因的导入整合效率较高，缺点是需要贵重精密仪器，技术操作难度较大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。并且，显微操作处理对鱼类卵子有机械损伤，受精卵的成活率受到很大影响。 2.2 电脉冲法 外源DNA在电脉冲作用下进入受精卵。 谢岳峰等(1989)以泥鳅脱膜受精卵为材料，电穿孔转移外源基因，获得了10% 的转基因泥鳅。 Powers(1992)采用电穿孔法和显微注射法，将线性化DNA 导入斑马鱼、斑鲴和鲤受精卵。电穿孔法产生的转基因鱼数量比显微法的多。 Zhao(1993)证明电穿孔导入的GH 基因不仅能表达，而且还能遗传。 Powers(1992)采用电穿孔法获得的转基因斑马鱼和鲤的子一代约一半携带外源基因并能有效表达。 缺点 优点 操作比较简单，是处理大量的受精卵的理想方法。 缺点是导入无定向性，转移率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件(脉冲电压、脉冲时间、脉冲次数、间隔时间、脉冲介质)等。 2.3 精子载体导入法 利用精子作为转基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，是构建转基因动物的一种新的尝试。 目前鱼类的成功报道有6种。 Khoo等(