免疫介导运动神经元损伤模型的建立及其发病机理-神经病学专业毕业论文.docx

中文摘要氧化酶GST、NQ01和H0—1的表达变化，探讨氧化应激在运动神经元损 中文摘要 氧化酶GST、NQ01和H0—1的表达变化，探讨氧化应激在运动神经元损 伤中的作用；第四部分应用常规透射电镜及电镜细胞化学技术，观察脊髓 前角运动神经元及其周围胶质细胞的超微病理改变，以及钙的异常沉积， 为钙稳衡改变参与运动神经元损伤过程提供超微形态学依据。 第一部分实验性免疫介导运动神经元损伤动物模型的建立 目的：建立免疫介导的运动神经元损伤动物模型，应用病理学、电生 理学、血清学和免疫组织化学技术对运动神经元变性和丢失、肌肉失神经、 ，q 血清抗豚鼠脊髓前角抗体的存在以及IgG原位组织内沉积等进行评价，制 成临床、病理以及电生理上与人类ALS相似的稳定的动物模型。 方法：取成年雄性白化病远交系Hanley豚鼠，以1ml新鲜牛脊髓前 角匀浆(含牛脊髓前角湿重O．189~O．249，O．5ml弗氏完全佐剂和O．5mlPBS) 制成油包水乳剂，于豚鼠背部皮下／皮内分5～6个点进行接种。4周后以弗 氏不完全佐剂制成的相似的抗原悬液再次免疫动物，共免疫4次。免疫对 照组豚鼠去除免疫原(牛脊髓前角匀浆)以同样方法接种。实验期间每天 观察动物，评价其活动速度、稳定性及肢体对针刺的反应等，每周称体重 一次，每月做一次肌电图。免疫组于症状晚期(判定标准：实验动物不能 自行翻身)、对照组于相应时间点取材，切取大脑皮层、大脑脚、脊髓颈 腰膨大、坐骨神经和后肢肌用于艇、甲苯胺兰、坚牢蓝、神经纤维单丝 锇酸染色、IgG免疫组织化学染色及透射电镜观察；计数脊髓前角运动神 经元数目；同时，测定血清内抗豚鼠脊髓前角抗体滴度。 结果：牛脊髓前角匀浆免疫后豚鼠出现了缓慢起病、进行性发展的肢 体无力、肌肉萎缩；肌电图示正尖波、纤颤电位等失神经改变及运动单位 电位波幅增高、时限增宽；运动皮质大锥体细胞可见线粒体肿胀及内质网 扩张，大脑脚有髓神经纤维轴索萎缩、线粒体肿胀；脊髓颈腰膨大前角可 见染色质溶解、核偏位、神经元皱缩浓染及胶质细胞增生；与对照组相比， +F 脊髓前角运动神经元计数显著减少，后角神经元无明显改变。免疫组豚鼠 血清内抗豚鼠脊髓前角抗体滴度高达1：12 800，脊髓前角运动神经内可见 IgG沉积。 结论：本实验成功建立了免疫介导的运动神经元损伤动物模型，临床 表现和病理改变与人类ALS相似。本模型的建立为进一步研究免疫作为 始动因素引起运动神经元变性和损伤的机制及其防治的实验性研究提供 中文摘要了有利条件。 中文摘要 了有利条件。 第二部分星形胶质细胞在脊髓运动神经元损伤中的作用研究 目的：在免疫介导的运动神经元损伤动物模型的基础上，应用免疫组 织化学和免疫印迹技术，研究运动神经元丢失过程中星形胶质细胞的反应 及其特异性细胞骨架蛋白GFAP、星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1的表 达变化，探讨谷氨酸兴奋毒机制的可能作用。 方法：取成年雄陛白化病远交系Hanley豚鼠，以1ml新鲜牛脊髓前 角匀浆(含牛脊髓前角湿重O．1 89~O．249，O．5ml弗氏完全佐剂和O．5mlPBS) 制成油包水乳剂，于豚鼠背部皮下／皮内分5～6个点进行接种。4周后以弗 氏不完全佐剂制成的相似的抗原悬液再次免疫，共免疫4次。免疫对照组 豚鼠去除免疫原(牛脊髓前角匀浆)以同样方法接种。免疫组分别于临床 症状出现前(第一次免疫后3~4周)和症状晚期(不能白行翻身)取材， 对照组于相应时间点同时取材。脊髓颈、腰膨大分别用于GFAP和GLT-1 免疫组织化学染色，同时提取组织蛋白，用于㈣和GLT-1免疫印迹 分析。 结果：免疫组豚鼠症状前即可见星形胶质细胞增生，症状晚期更明显， 与运动神经元变性程度有关；症状晚期GFAP表达与对照组相比有显著增 高。所检测的症状晚期豚鼠中，2／5只存在脊髓前角GLT-1表达下降，与 对照组相比有显著性差别。 结论：免疫所致运动神经元损伤过程中存在反应性星形胶质细胞增 生，且可先于临床症状的出现。星形胶质细胞谷氨酸转运体GI卫1免疫 表达的下降提示谷氨酸转运障碍所致兴奋毒性损伤可能在免疫介导的运 动神经元损伤过程中起一定作用。 第三部分Nrf2及抗氧化酶在脊髓运动神经元损伤中的表达 目的：通过检测脊髓前角星形胶质细胞和运动神经元核转录因子Nrf2 和几种抗氧化酶的表达情况，了解免疫介导的运动神经元损伤过程中 Nr也／-6岫信号通路有无变化，从氧化应激的角度探讨运动神经元损伤的 可能机制。 方法：取成年雄性白化病远交系H毗lev豚鼠，以lml新鲜牛脊髓前 角匀浆(含牛脊髓前角湿重O．189～O．249，O．5ml弗氏完全佐剂和O．5mlPBS) 制成油包水乳剂，于豚鼠背部皮下／皮内分5～6个点进行接种。4周后以弗 中文摘要氏不完全佐剂制成的相似的抗原