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第五章 蛋白质的定性定量检测 第一节 免疫组织化学的基本理论 第二节 蛋白质的定量检测 第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量 第四节 酶联免疫吸附试验（ELISA） 第一节 免疫组织化学的基本理论 一、形态学研究的方法（S） 二、组织化学 三、免疫组织化学 一、形态学研究的方法（S） （一） 普通光镜术 （二）特殊光镜术 1. 荧光显微镜 2. 相差显微镜 3. 暗视野显微镜 4. 激光扫描共聚焦显微镜 （三）电镜术 1. 透射电镜术 2. 扫描电镜术 3. 冷冻蚀刻术 二、组织化学（histochemistry） 组织化学（histochemistry）：以组织学为基础，应用物理和化学的技术方法显示细胞组织结构中的各种化学成分，并对这些物质进行定位、定性和定量，从而分析研究生物体在生理或病理状态下细胞和组织代谢、功能及形态变化规律的科学。 细胞化学技术（S） 细胞化学技术能够对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能产生同样良好的效果。 目前，用细胞化学技术所能显示的化学成分有蛋白质（显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、RNA、DNA、糖类（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂类（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（如磷酸酶）、特异抗原（其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、无机盐和微量元素（如铁、铜、锌、镁等）。 原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物。常见的有： 1. 孚尔根反应法（Feulgen reaction）：显示DNA呈现紫红色。 2. 甲绿-派郎宁法（Methyl Green-Pyronin method）：显示核酸（甲绿染DNA呈现绿色，派郎宁染RNA呈现红色）。 3. 苏丹Ⅲ冰冻切片染色：显示中性脂肪呈现橘红色。 4. 普鲁士蓝反应：显示组织中含铁血黄素。 5. 过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiff reaction，PAS）：显示糖原和其它多糖物质为紫红色。 三、免疫组织化学（immunohistochemistry） （一）免疫组织化学的概念 （二）免疫组织化学的简要步骤 1. 抗体（anbibody，Ab）的制备 （1）抗原的提取和纯化 （2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体 （3）抗体效价检测和纯化 （4）标记复合物的制备 2. 抗原（antigen，Ag）的检测 （1）细胞或组织切片的制备 （2）免疫组织化学反应和显色 3. 结果观察和记录 （三）抗原-抗体反应 抗原-抗体反应：由抗原物质刺激机体产生相应的特异性抗体后，抗原和其特异性的抗体在体内或体外发生结合反应的过程。 利用抗原、抗体在体外可以发生特异性结合反应的特点，将其应用到细胞组织化学中，可对各种抗原或生物活性物质进行分离及检测。 （四）免疫标记化学反应与检测 免疫标记化学反应：用荧光素等发光剂、酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的温度和pH等），标记抗体与抗原发生特异性的反应。 常用标记物 1. 荧光素 （1）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）：绿色荧光； （2）四乙基罗达明：橙红色荧光； （3）四甲基异硫氰酸罗达明：橙红色荧光； （4）藻红蛋白：红色荧光 2. 酶 （1）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）； （2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 3. 金属标记物：如胶体金，多用于免疫电镜。 4. 放射性核素：涉及污染，防护难，一般不用。 检 测 酶等呈色物与一定的底物结合后，可以形成具有特殊颜色的化合物，即可知道呈色物标记的抗体与相应的抗原形成的复合物的存在情况。 荧光物质可以在高压汞灯的激发下，发出特定颜色的荧光，可以在荧光显微镜下被观察到。 胶体金颗粒可以在透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）下观察。 放射性同位素可以使胶片感光，经放射自显影后就可以知道标记抗体与抗原反应的情况。 （五）常用免疫组织化学染色方法 1. 直接法 2. 间接法 3. PAP法 4. APAAP法 5. ABC法 6. SABC法 7. LSAB法 8. SP法 9. SAP法 1. 直接法 2. 间接法 先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点： （1）较直接法灵敏。 （2）可标记一种抗体，检测多种抗原。 3. 过氧化物酶-抗过氧化物酶法（Peroxidase anti-peroxidase method，PAP） 先将过氧化物酶（HRP）免