单克隆抗体和基因工程抗体.pptVIP

抗体库技术产生的三项技术基础 ? RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 ? 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 ? 噬菌体展示技术（phage display) 噬菌体抗体库技术 将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白Ⅲ基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法即可筛选出特异性抗体。 接头DNA VH VL 噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 噬菌体抗体图示 抗体库的构建 抗体库的富集筛选 抗体库技术的应用 ● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体 四 抗体药物的临床应用 (1) 小分子抗体 1 2 3 免疫球蛋白 基因载体的构建 H链表达载体 L链表达载体 共转染细胞 Pr VH CH1 Pr VL CL Fab 抗体分子的制备 I Fab antibody molecule 抗体分泌细胞 VH VL CL -S-S- CH1 Fab 抗体分子的制备 II Fv antibody molecule 分别构建载体 L链表达载体 H链表达载体 共转染细胞 Pr VH Pr VL Fv [二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)]小分子抗体的制备 (1) ds-Fv 抗体分泌细胞 VH VL -S-S- Fv小分子抗体的制备 disulfide-stabilized Fv, ds-Fv VH VL 接头DNA (Gly4Ser)3 VH引物 PCR VH 接头DNA 酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建 变性、复性 VL引物 (2) Sc-Fv VL III Diabody structure 双特异性抗体 抗原A 抗原B -S-S- Fab VH CH1 VL -S-S- CH1 VH VL Fv VH VL CTL CD3 TUMOR CELL -S-S- VH CH1 VL -S-S- CH1 抗原A 抗原B (2) 抗体融合蛋白 ?抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 ?含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能 Fc protein SPA thrombin Fc的作用：检测、纯化、 G-CSF Fc Fusion Protein DNA ligation expression Fc的作用：延长血清中半寿期 DNA ligation P-GGG - HO-CCC - -CCC - OH -GGG - P -G - OH P-AATTC- -CTTAA-P HO-G - 5’ 3’ 3’ 5’ T4 DNA ligase ATP Klenow fragment dNTP -GAATT-OH P - AATTC- -CTTAA-P HO-TTAAG - 3’ 3’ 5’ 5’ + P-GGG - HO-CCC - -CCC - OH -GGG - P blunt ends Klenow fragment dNTP Klenow fragment E.coli DNA polymerase I Protease 5’-ATCGGAAATGCCGTAGTAACG-3’ 3’-TGC-5’ dNTP DNA polymerase I :