高速冷冻离心机.PPT

采用Beckman Ti80头超速离心。 按60％（W/V）配制，即4ml上清液加入6g氯化铯，装入适合的离心管，将溶液加温至30℃，使其溶解，再加0.2ml 溴化乙锭（10mg/ml），管上层加入8ml 42％氯化铯（W/V）溶液（事先将氯化铯溶于TE缓冲液中），如管口不满可用轻石蜡油添满，平衡各离心管，并盖紧管盖，装入Ti80头中，在4℃下，65000rpm离心5小时；离心后，在普通光照下应能见到两条DNA带，上面区带含有线形DNA和有缺口的环状质粒DNA，下面的区带有闭合环状质粒DNA。管底为溴化乙锭RNA复合物；在长波长紫外灯下检测。 小心插入定量毛细管于下面一层质粒DNA带上，用电子微量泵将它吸出，放入磨口刻度离心管中。从DNA中除去溴化乙锭，用等体积异戊醇抽提3次～4次，每次轻微翻转数次，离心后取下层无色的水相，直至无红色出现为止；将抽提后的无色溶液装入0.5cm直径的透析袋中，对TE缓冲液透析24小时～48小时，并换液数次以除去氯化铯，或者用3倍体积水进行稀释并于0℃用2倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的6倍）沉淀DNA20分钟，于4℃下，12000rpm离心30分钟，收集沉淀，沉淀用70％冷乙醇洗一次，同上条件离心，去除上清液，沉淀于真空下抽干，溶于少量TE缓冲液中，置低温冰箱保存备用。 转头（rotor）是离心机分离样品的核心部件，它的转速与转头的材料及强度有关。 低速离心机一般采用强度好，重量轻的超硬铝合金； 超速离心机采用钛合金。 一般来说，对同一类型离心机重量轻、容量小的转头转速要高；反之转速要低。 三、离心机转头的分类应用及功能 1.固定角转头(fixed-angle rotor）： 主要用于分离沉降速度有明显差异的颗粒样品。但具有“壁效应” ，在离心管内将会引起强烈的对流，影响分离纯度。 固定角转头 2.甩平式转头(swing out rotor, swing backed rotor):用于样品作低密度梯度离心，有敞开式和封闭式两种。 敞开式转头用于制备容量大、转速小于10000rpm、离心力场在16000xg以内时，主要用于样品的初分离。 敞开式转头 封闭式转头 封闭式转头制备容量较敞开式小，转速大。主要用于线粒体、细胞核等的分离和密度梯度离心。 3.连续流动转头(consecutive flow rotor） 主要用于悬浮介质中高速分离较小的颗粒物质，这种转头是利用离心淘析技术在无菌和低温条件下，被分离的组份，能保持活性，回收率高等优点。被广泛应用于科研和实验室工作。 连续流动转头 当转子在运行速度旋转时，样品不断地通过密封组件中心管道泵入转子内，沿着轴心流底部 ，井在离心力的作用下使样品颗粒和其它溶液移动到密度梯度表面层 。 该技术对大规模分离提取和富集组织培养液、植物病毒 、动物病毒和虫病 毒是非常有用 的技术 ，另外也可 以用来收获细菌 ，纯化组织匀浆中的亚细胞结构和水污染研究中分离粘土颗粒 4.区带转头(zonal rotor) 主要用于大容量的密度梯度离心，转头由四块叶片的转头体和密封系统构成四个扇形小室，叶片上有径向导管，梯度液通过密封管道泵入转子内，然后通过密封组件中心输液管加入样品。由于试样及溶剂直接接触转头，所以对转头的耐腐蚀性要求高，区带转头避免了用离心管所引起的壁效应和干扰，提高了分辨率。 区带转头 扇形小室 叶片 径向导管 5.垂直转头（vertical rotor） 使用垂直转头对离心管密封要求严格，需要加离心管帽或用可热封的塑料离心管。垂直转头是一种固定角转头，离心管垂直放置。垂直转头分离的粒子位移距离等于离心管直径，主要用于样品在短时间作密度梯度离心。 垂直转头 四、离心机的主要技术参数及性能指标 (一)、离心机的主要技术参数 1.最大转速:离心转头可达到的最大转速，单位是rpm 2.最大离心力:离心机可产生的最大相对离心力场RCF，单位是g 3.最大容量:离心机一次可分离样品的最大体积，通常表示为m X n。m为一次可容纳的最多离心管数，n为一个离心管可容纳分离样品的最大体积，单位是ml； 4.调速范围（转速设置范围）:离心机转头转速可调整的范围 5.温度控制范围:离心机工作时可控制的样品温度范围 6.工作电压:一般指离心机电极工作所需的电压 7.电源功率:通常指离心机电机的额定功率 标记符号 名称 转头参数 意义 FA 固定角转头