鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究-动物营养与饲料科学专业论文.docxVIP

糠江太擘霭±擘链、电熏 糠江太擘霭±擘链、电熏 鸡眭壤始生毽细貔增殖谭整枫釉的研究 摘 要 家禽常被用作发育生物学研究的动物模型。很多研究致力在更深层次揭示家禽发育的机 理，尤其是生殖系统的发育，在内源性调节的基础上力图通过外源性调控，以提高家禽的繁 殖性能。本实验以艾维因鸡胚为材料，分离了胚胎期原始生殖细胞(PG-C)。并进行了原代 和传代培养及其分化潜能的检测，探讨了多种体细胞对P}(泥体外增殖的影响，研究了植物 性生物活性物质大豆黄酮(DAD和槲皮素(QUE)对POC增殖的作用及其胞内信号传导 机制。 1．鸡胚原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立 在体视显微镜下用玻璃针分离3．5√Id鸡胚生殖嵴，用胰蛋白酶+EDlA消化分散组织， 以含5％胎牛血清(FCS)的M199培养液进行PGC和体细胞的共培养，从而建立其原代培养 模型，然后将PGC传代到饲养层上进行传代培养。结果表明5％FCS在POC与体细胞原代 培养中有较好的促增殖作用，而在传代培养时，添加了5％FCS的培养液和无血清ITS培养 液(10 pg／mi胰岛素、5坞，mI转铁蛋白和3x104 moFL亚硒酸钠的培养液)能较好地维持 并促进P‘3C的存活和细胞集落数的增加(P∞．05)；碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反 应(PAs汲c-Mr和SSEA．1免疫细胞化学染色均证实所分离的细胞为P(把：传代的PGC在 饲养层上培养60h后增殖细胞核抗原(PCNA)染色呈强阳性。提示培养的PGC具有较强 的增殖活性。体外分化实验表明PGC在去除饲养层和生长因子的情况下能分化成多种细胞， 根据其形态可分为神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。经神经元特异性烯醇化酶 (NsE)和角蛋白免疫细胞化学鉴定，证实了神经元样和上皮样细胞的免疫学特征，表明培 养的POC具有分化的多能性。上述结果表明经PGC．体细胞原代共培养后再传代于饲养层上 进行传代培养的模型可以用作PGC增殖活性和分化潜能的研究． 2．体细胞对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控作用 为了探讨鸡胚POC生长的理想支持体系，实验采用三种来源于鸡不同的体细胞(成纤 维细胞、骨骼肌细胞和鸡小黄卵泡颗粒细胞)制备饲养层。比较三种体细胞对PGC生长和 增殖的影响。周肘在三种体细胞饲养层上添加FCS、生长因子及白血病抑制因子(UF)，比 较不同生长因子或细胞因子对PGC生长和增殖的影响。另外，用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入 显示细胞的增殖活性。部分POC作传代培养，并添加FCS、LIF和人参皂甙(GS)以研究 其对PGC传代增殖的影响．结果表明成纤维细胞饲养层和卵泡颗粒细胞饲养层对鸡胚P(圮 的存活和增殖效果较骨骼肌饲养层好，PGC数目明显多于后者(P如．05)．且BrdU标记染 色表明成纤维细胞要优于颗粒细胞：生长因子和细胞因子的比较发现，在三种饲养层上，0．5 ％FCS+LIF(10ng／m1)组效果最好，其次是ITS组和FCS组．而单独添加LIF组的效果较 差，尤其在颗粒细胞上表现更明显(p∞．05)．传代培养发现，铷d后PGC大量增殖，特 别是添加了GS(IOpg／m1)后形成更大的细胞团，效果更为明显。结果提示：鸡胚POC在 鸡胚成纤维饲养层上培养效果较好，是鸡胚PGC较理想的支持体系；且添加低浓度血清和 浙江大学博士学位论文码!癌：荣殆生翅．鲴r廖埔稽调整扰韵叻瑷疗 浙江大学博士学位论文码!癌：荣殆生翅．鲴r廖埔稽调整扰韵叻瑷疗 LIF及抗氧化性营养素GS对PGC的增殖有明显的促进作用． 3．聋白激酶A和c系统对鸡胚PGC增殖的调控机蠲 利用PGC培养模型探讨了蛋白激酶A(PKA)和c(PKc)信号系统在PGC增殖中的 作用．传代培养时，培养液中分别添加腺苷酸环化酶激活剂福司克林(FRSK)和佛波酯 (PMA)以分别活化PICA和PKC，并与相应的抑制剂H和}b联合处理tCd2；用BrdU标 记细胞的增殖情况。实验结果表明FRSK(10—1—10。M)刺激鸡胚PC_d2的增殖(P0．05)．这种效应可被H(10。M)所抑制(Po．05)；PMA(10SM)t㈣促进PGC的增殖。 其促增殖作用可被H(10～一lo-M)所抑制(P(0．05)。BrdU免疫细胞化学法检测表明FRSK 及PMA处理后细胞BrdU标记指数明显增高，说明PGC具有较强的增殖活性。从而证明了 PKA和PKC信号通路在鸡胚PGC的增殖过程中起着重要的调控作用． 4．类黄酮对鸡胚PGC增殖的调控及其机制豹研究 利用PGC传代培养模型研究两种类黄酮DAI和QUE对鸡胚PC,-C增殖的影响，并探讨 了其作用机制。结果表明，DAI(IPg／m1)和QUE(0．01-11Jg／m1)显著促进IW_,C的增殖(Po．05)： 到10Pg／ml时二者对细胞发生毒性作用