鸡毒害艾美耳球虫MIC5基因在大肠杆菌的重组表达产物抗原性分析-预防兽医学专业论文.docxVIP

摘‘ 摘‘ 要 从鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中提取基因组DNA，用Oli906．0软件设计EnMIC．5基因特异 性引物，通过PCR扩增出l 470 bp的片段，扩增产物再连接到pMDl8．T载体中，经PCR扩增、酶 切鉴定和测序分析后证明所克隆的l 470 bp片段核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与GenBank中登 录的微线蛋白5基因序列的相似性分别是99．7％和99．6％。 按照pET-28(a)+载体的特点和克隆位点，用Oli906．0软件设计了含BamH I和Xho I酶切位点的 EnMIC．5基因的特异性表达引物，以重组pMDl8．T-EnMIC．5质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩 增产物经BamH I和Xho I双酶切后，将外源EnMIC．5基因亚克隆到pET-28(a)+表达载体中，构建 pET-EnMIC．5重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经酶切、PCR和测序鉴定证明EnMIC．5 基因正确插入到pET-28(a)+载体中。经ITPG诱导表达，表达产物通过SDS和Western-blotting 分析证实EnMIC．5基因在BL21中成功表达，分子质量大小为57．5 lcu左右，与预期的分子质量大小 一致，且能被鸡毒害艾美耳球虫阳性血清所识别；将重组蛋白免疫昆明小鼠，用间接ELISA检测， 证实该重组蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高