高效薄层色谱HPTLC.PPT

预制板 定性分析— 窄条 定量分析— 10×20cm 硅胶G：自含粘和剂 硅胶H：不含粘和剂，铺板时另加入 CMC 硅胶HF254：含荧光剂，254 nm 紫外光照发绿光 硅胶HF365：含荧光剂，365 nm 紫外光照发光 表11-3 2、点样 （1）控制点样量，防止拖尾1-10μL 点样量 = 样品溶液浓度×点样体积 （2）控制斑点大小：一般在2～3mm 3、展开 （1）饱和展开 饱和展开箱展开是指在展开前，箱内的各种气液达到平衡（饱和），展开过程中，薄层上的溶剂不再蒸发，重现性好。 （2）不饱和展开 不饱和展开箱展开是指展开箱中气体与溶剂蒸气、薄层未达到动态平衡时即开始展开；展开过程中，薄层上的溶剂不断地在薄层表面上蒸发，从而造成结果重现性差及边缘效应 边缘效应：即同一种组分在同一块板上，处于边缘的点的Rf值大于中心点。 原因：a、边缘处溶剂挥发快；b、多元溶剂时，易挥发溶剂在边缘挥发快，从而难挥发溶剂（极性大）相对比例大，洗脱能力强，使斑点移动快。 （3）展开方式 上行法、下行法、水平展开。 （4）特殊展开技术 连续展开（相当于增加展开距离） 单向多级展开 双向展开 分级展开（自动多步展开仪） 4、检出 显色、定位 有色物质直接定位。 无色物质 紫外光下定位（λ254，365）。 荧光定位：发射荧光的物质 在荧光背景下显暗斑的物质（荧光熄灭） 显色定位（化学显色） I2蒸气（棕黄色） 浓硫酸/MeOH（1:1）或10% H2SO4-乙醇溶液喷雾后，110℃烘烤 专属显色剂 喷雾：人工、机械 （五）定性分析 1、比移值Rf、R（保留比） R’= 1 /（1+CsVs / CmVm） =1 /（1+KVs / Vm） Rst相对比移值 图12-8 平面色谱展开示意图 比移值Rf、R影响因素 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为。 k大，则移动慢，比移值小, Rf↓ ； 正相薄层板，对于极性组分 展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易洗脱） Rf范围：0 Rf 1（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.2～0.8（常用）；0.3～0.5（最佳） 2、流动相的速率 与柱色谱相比，TLC、PC中，流动相的速率是不恒定的，展距越大，速率越小。 3、固定相的变化 平面色谱操作大多是敞开的，与大气接触，与柱色谱不同。在上样时，吸附薄层会吸收空气中的水或减活，从而造成结果不重现。 定性 (1) Rf值定性 影响Rf值的因素：饱合程度、湿度、温度 (2)多种溶剂系统定性 改变：a、极性 b、酸碱性 c、种类（组别） d、正向、反相色谱 （六）定量 (1)直接测定 目测 斑点面积 薄层扫描TLCS (2)间接测定（洗脱测定） 分离后刮下相应的固定相，用溶剂将组分洗下，进行紫外测定。 （七）薄层扫描法（ TLCS） 薄层扫描法 基本原理: 样品经薄层分离后直接测定或经适当处理使之显色或产生荧光，在特定波长下，用光度计测其吸光度或荧光强度的方法称为薄层扫描法。 薄层扫描仪 测定方法：吸收测定法（UV-Vis）、荧光测定法 1、吸收测定法 利用可见光或紫外光照射展开后的薄层，测定色谱斑点的吸光度 A 随展开距离 L 的变化，得到 A-L 或 A-Rf 曲线，即薄层扫描图。色谱峰面积，可用于定量分析。 由于薄层板存在明显的散射和反射现象，所以斑点中组分浓度与 A 的关系不服从 Beer 定律，需要 Kubelka-munk 理论来描述。 理想空白薄层板的单位薄层厚度的吸光系数 K=0，实际上，K≠0，为消除此影响，以空白板为基准，测定空白透光率或反射率来计算斑点的吸光度。 透射法 透光率： A = -lgT/T0 空白板和斑点 T0=i0/I0 ； T=i/I0 反射法（常用） 反射率： A = -lgR/R0 空白板和斑点 R0=j0/I0； R=j/I0 2、荧光测定法 荧光：某些物质吸收特定波长的光后，除产生吸收光谱外，还会发射比原来吸收波长更长的光。 灵敏度高，但适用范围窄，要求组分发射荧光（衍生） F=ФI0 abc Ф： 荧光效率 I0：入射光强度 a： 吸光系数 b： 薄层厚度