可示踪的防龋基因疫苗构建、表达及其基因疫苗PELA微球的研究-病原生物学专业毕业论文.docxVIP

博士学位论文．摘要可示踪的防龋基因疫苗构建、表达 博士学位论文．摘要 可示踪的防龋基因疫苗构建、表达 及其基因疫苗PELA微球的实验研究 病原生物学专业 博士研究生：刘莉 指导教师： 贾文祥教授 摘 要 本研究将微生物学、免疫学、分子生物学和生物材料学等多学科有机结 合起来，运用基因重组技术构建了可示踪的防龋基因疫苗；对可生物降解材 料作为防龋基因疫苗释放系统进行了研究；并对防龋基因疫苗在体I勾#1-的表 达以及不同方式免疫的BALB／C小鼠的特异性抗体进行了检测。通过GFP 的指示作用及免疫组化方法，对防龋基因疫苗在体内外的表达进行初步的示 踪研究，为防龋基因疫苗的临床应用奠定基础。本研究共包括四个部分。 第一，本研究构建了以绿荧光蛋白基因作为报告基因的可示踪的防龋基 因疫苗。利用PCR方法，扩增变异链球菌(Streptococcimutans，S mutans) MT8148菌株表面蛋白抗原PAC氨基端的基因片段pac-A(1．3Kb)。PCR产物 与真核表达质粒pEGFP—C1双酶切，并回收相应DNA片段后，采用DNA连接 试剂盒进行连接重组，转化。转化子中的重组质粒经双酶切鉴定，获得了 4．7Kb与1．3Kb两个片段；重组质粒中插入基因的序列测定表明，该插入序 列与pac全基因的314—1630bp的核酸序列完全相同，插入基因的两侧分别 与Kpn I和Apa I酶切位点的序列一致，插入基因的上游有起始密码子，下 游有终止密码子。以上结果均证实该重组质粒构建正确，目的基因pac-A定 向插入至真核表达载体中，未改变目的基因的阅读框架。我们将此重组质粒 命名为pEGFPCI—pacA。该重组质粒的成功构建为下一步实验的顺利进行提供 了可靠的保障。 第二，为了检测构建的可示踪的防龋基因疫苗能否在哺乳动物细胞中正 l 博：L学位论文-摘要 博：L学位论文-摘要 确表达出来，将构建正确的重组质粒pEGFPCI—pacA采用脂质体Lipofectin 试剂介导转染COSl细胞。通过荧光倒置显微镜直接观察和流式细胞仪测定 荧光强度指示GFP的表达；采用RT—PCR法检测重组质粒中pac-A基因在COSl 细胞中的转录i并用蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)检测转染细胞上 清液pac-A基因的表达。结果在荧光显微镜下观察到了发绿色荧光的COSl 细胞，重组质粒组细胞的平均荧光强度高于阴性对照细胞组，表明重组质粒 能『F确表达出绿荧光蛋白；RT—PCR扩增获得了1．3Kb的片段；表达产物的 Western blot结果显示，在分子量为56 KD与89 KD处有两条杂交阳性带， 其分子量分别与pacA基因表达产物与pac-A-gfp融合基因表达产物的推算 值相符，表明重组质粒中pac-A与gfP基因能正确表达并可分泌至胞外，而 且能与特异性抗体结合，具有免疫学生物活性。上述结果表明，构建的可示 踪的防龋基因疫苗能在哺乳动物细胞中正确表达出来，报告基因gfP与目 的基因pacA在哺乳动物细胞中具有转录和翻译活性及其相应的生物学活性， 这为可示踪的防龋基因疫苗的动物体内实验提供了良好的材料。 第三，本实验旨在为防龋基因疫苗寻找一种有效的释放系统。以聚乳酸 ．聚乙二醇共聚物(PELA)为材料，采用改进的溶剂挥发法双乳液(wI／O／w2) 体系制备DNA／PELA复合物，在扫描电镜下观察其形态、粒度分布仪测定 平均粒径：测定了复合物中DNA的包封率、细胞外释放特征，及其包被对 DNA结构的影响：采用MTT法测定了PELA包被材料本身的细胞毒性；并 对其介导的DNA体外转染真核细胞的效果进行了检测。结果显示所制备的 复合物多为球形，平均粒径1．806业m：微球中DNA的包封率达78．9％，在细 胞外具有缓释的特征，DNA结构没有被破坏；PELA材料本身对细胞基本无 毒性；DNA／PELA微球能在体外直接转染COSl细胞，在荧光倒置显微镜下 观察到了发绿色荧光的被转染细胞；流式细胞仪测定重组质粒DNA／PELA 微球细胞组的平均荧光强度比阴性对照细胞组的高，但比阳性对照细胞组 低；用RT．PCR检测重组质粒阳性对照组及DNA／PELA转染组的pac-A基因 的转录，结果显示，重组质粒阳性对照组细胞和DNA／PELA组细胞组均能 检测出pac-A基因的转录，但初步判断后者的转录水平较前者低。上述结果 表明被微球包裹的DNA能在体外转染哺乳动物细胞，并在细胞内正确地转 录、翻译出相应的产物，其生物学功能没有被破坏。但在体外转染效率较低， 其原因可能与微球缓慢释放被包裹的DNA有关。 堡!：兰壁堡苎：塑兰 堡!：兰壁堡苎：塑兰 第四，为了进一步证实构建的可示踪防龋基因疫苗的免疫学活性，以及 PELA基因疫苗释放系统对免疫效果的影响，我们进行