比浊法操作手册.docVIP

PAGE PAGE 5 比浊法操作规程 一、准备工作： （一）培养基的制备： 1、III号培养基的制备 胨 5 g 葡萄糖 1 g 牛肉浸出粉 1.5 g 磷酸氢二钾 3.68g 磷酸二氢钾 1.32 g 氯化钠 3.5 g 酵母浸出粉 3 g 水 1000 ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。 2、营养琼脂培养基的制备 按照营养琼脂培养基上标注的比例系数，进行营养琼脂培养基和纯化水配制。 或者按照药典进行配制。 胨 10 g 氯化钠 5 g 琼脂 15~20 g 肉浸液 1000 ml 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 3、注意事项 （1）含有葡萄糖的培养基应在各成分加热溶解后再加入，其目的是防止葡萄糖加热被破坏。 （2）配制的培养基必须调节pH值，保证培养基灭菌后其pH值在规定范围之内；测定硫酸庆大霉素的培养基pH值灭菌后最好在7.15～7.20。pH值的测定使用酸度计或其它准确度较高的仪器，使用20%的氢氧化钠溶液或浓盐酸进行调整；调节pH时应避免反复调节。 （3）配制的培养基应透明、无沉淀。应先调节pH再分装后灭菌。 （4）配制好的培养基应储存在冷处，出现浑浊后不能继续使用。 （二）缓冲液的制备： 1、pH7.0磷酸盐缓冲液 （BP） 磷酸二氢钾 13.6 g 氢氧化钠 2.37 g 灭菌水 2000 ml 2、pH7.8磷酸盐缓冲液 磷酸氢二钾 5.59g 磷酸二氢钾 0.41 g 水 1000ml 3、注意事项 （1）所用化学药品规格不低于二级试剂(AR)规格。 （2）配制后若出现沉淀或浑浊应用耐酸滤过漏斗滤过，使溶液澄清。 （3）缓冲液配制后应澄明无色、无菌、无浑浊沉淀，应避免被毛点、纤维污染。 （4）配制后应灭菌保存使用。 （三）试验菌： 菌悬液的制备： 金黄色葡萄球菌悬液 取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 大肠杆菌悬液 取大肠杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20~22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 白色念珠菌悬液 取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10 mlⅨ号培养基中，置35~37℃培养8小时，再用Ⅸ号培养基稀释至适宜浓度，备用。 （四）实验器具： 1、比色皿及大口吸管的清洗、灭菌： 用自来水冲洗比色皿5次以上，再用去离子水将每个比色皿清洗三次，放入恒温干燥箱，150～160℃干热灭菌1～2小时。加培养基和菌液用大口吸管依次用自来水、洗涤液、自来水冲洗干净，用纯化水冲洗三次，用牛皮纸逐支包好，150～160℃干热灭菌1～2小时，备用。 2、容量瓶、移液管、刻度吸管等精密计量器具的清洗、灭菌： 依次用自来水、洗涤液、自来水洗涤，用纯化水冲洗三次，必要时于150～160℃干热灭菌1～2小时。 3、注意事项 比浊法所用器具应避免抗生素及微生物污染，必要时精密计量器具应进行灭菌。 （五）抗生素溶液的配制： 精密称取标准品或供试品适量（制剂产品可根据剂型选择适当的方法）于容量瓶中，配制成浓度为1000u/ml的溶液，选择适当的方法稀释至规定浓度。 二、比浊法操作过程： 1、标准品溶液及供试品溶液的制备 可按各品种的具体规定，稀释制备，也可以进行预试验，选择合适的浓度比，如果试验菌的灵敏度高可以选择低的剂间比，如1.25:1；如果试验菌的灵敏度低则可选择较高的剂间比，如2:1或4:1等。 2、标准品溶液及供试品溶液的分装 取备好的大试管16支，分配dS14支，dS24支，dT14支及dT24支，分别作好标记，按照拉丁方顺序排列。将标准品溶液dSl、dS2及供试品溶液dT1、dT2各1.0毫升按编号加入相应的大试管中。注意：加入溶液时，均在有标记处沿管壁移入，以便在分装培养基时，可沿此处管壁流入，将沾在试管壁上的抗生素充分洗入培养基内（如有自动加样装置，则可免去此手工法操作）。 比浊法大试管拉丁方排列示意图 3、比浊法试验用培养基的接种