几类常用外用中药成份对人皮肤成纤维细胞胶原代谢的调节作用.doc

北京中普蕖大等 ＢＥＩＪＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣｌＮＥ硕士研究生学位论文题目：月名廷常用夕卜Ｊ书中药廊蝴人皮蹦减 纤维细胞胶原代谢的调节作用专 业：中西医结合基础（病理学）研究方向：中医药对创伤修复的作用硕士生：张玮导 师：黄启福教授 李萍教授 李克玲教授 二ｏＯ六年五月中文摘要 中文摘要 慢性皮肤溃疡是临床常见病，可继发或并发于多种疾病，治疗比较困难。在慢性皮肤溃疡发病过程中胶原代谢失常起着至关重要的作用。慢性皮肤溃疡创面内胶原合成能力降低和胶原分解过度，成为创面难愈合的重要原因。临床常用的外用中药有四类：祛腐类药物，如轻粉、红粉、雄黄、砒石等；活血类药物，如乳香、没药、血竭、三七、琥珀、大黄等；温补类药物，如人参、黄芪、鹿茸、肉桂等；敛口生肌类药物，如炉甘石、珍珠粉、煅石膏等。临床和动物实验均证明外用中药合理配伍运用治疗慢性皮肤溃疡疗效显著。为研究这四类药物的作用环节和机制，本论文以体外培养人皮肤成纤维细胞（ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＨＳＦｂ）为对象，选用这四类药物临床常用代表药物的有效成份：三氧化二砷（祛腐类）、血竭素和乳香水提物（活血类）、鹿茸多肽（温补类）、水溶性珍珠粉（敛口生肌类），比较这几类中药成份对成纤维细胞胶原代谢的调节作用，明确其作用靶点和作用机制，为中医外科治疗慢性皮肤溃疡治则、遣方用药提供科学实验依据。 本文首先对胶原代谢与慢性皮肤溃疡的相关性，以及外用中药治疗慢性皮肤溃疡的研究现状进行了综述，为本论文的立题和研究奠定了基础，并在此基础上进行实验研究。 一、研究三氧化二砷（祛腐类）、血竭素和乳香水提物（活血类）、鹿茸多肽（温补类）、水溶性珍珠粉（敛口生肌类）对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。 方法：采用ＭＴＴ比色法检测成纤维细胞增殖和羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量。 结果显示： １、药物分别作用于ＨＳＦｂ ４８小时后，水溶性珍珠粉在１．２５×１０２～１×１０３ｕ ｇ／ｍｌ，血竭索在５～２０１／ｇ／ｍｌ，乳香水提物在０．６４－２×１０３ ｕ ｇ／ｍｌ，鹿茸多肽在６．２５×ｌＯ－３ ０．４ｕ ｇ／ｍｌ浓度范围内对ＨＳＦｂ具有促增殖作用，与对照组比较差异显著（Ｐ＜Ｏ．０１或Ｐ＜Ｏ．０５），三氧化二砷在０．１６～０．８ ｕ ｇ／ｍｌ浓度范围内对ＨＳＦｂ增殖具有抑制作用，与对照组比较差异显著（Ｐ＜Ｏ．０１）。 ２、药物分别作用于ＨＳＦｂ ４８小时后，水溶性珍珠粉在２．５×１０２～ｌ×１０３Ⅱｇ／ｍｌ，血竭素高氯酸盐在２．５～２０ｉｉ ｇ／ｍｌ，乳香水提物在０．６４－２×１０３ｕ ｇ／ｍｌ，鹿茸多肽在１．５６×１０－ａ ０．４ｐ ｇ／ｍｌ浓度范围内对ＨＳＦｂ胶原蛋白合成具有促进作用，与对照组比较差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｆ＜Ｏ．０１），三氧化二砷在３．２×１０～－０．８ ｕ ｇ／ｍｌ浓度范围内对ＨＳＦｂ胶原蛋白合成具有抑制作用，与对照组比较差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜Ｏ．０１）。 水溶性珍珠粉１×１０３ｕ ｇ／ｍｌ、血竭素２０ ｕ ｇ／ｍｌ、乳香水提物２×１０３ｕ ｇ／ｍｌ、鹿茸多肽０．４ ｕ ｇ／ｍｌ促进增殖和胶原合成作用最明显，三氧化二砷０．８ ｕ ｇ／ｍｌ抑制增殖和胶原合成作用最明显。这些浓度被作为以后的实验浓度。 二、研究三氧化二砷（祛腐类）、血竭素和乳香水提物（活血类）、鹿茸多肽（温！ ！！鲞堂旦！！旦！垫些堡翌△塞壁堕堑丝塑堕堕墨垡望塑塑羔堡旦补类）、水溶性珍珠粉（敛口生肌类）对体外培养人皮肤成纤维细胞胶原代谢的影响。 方法：采用酶谱法检测成纤维细胞分泌的ＭＭＰｓ活性，采用免疫细胞化学法检测ＴＩＭＰ—ｌ、ＴＧＦ—Ｂ ｌ蛋白的表达。 结果显示： １、酶谱法分析结果：ＭＭＰｓ活性条带在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳凝胶上呈蓝色背景上的白色透明带。根据低分子量标准蛋白鉴定，所有的ＨＳＦｂ上清液中均测出比较清晰的两条带，分别为：ＭＭＰ—ｌ（４５ ｋＤ），ＭＭＰ一２（６２ ｋＤ）。药物作用于ＨＳＦｂ ４８ ｈ后，水溶性珍珠粉、鹿茸多肽对ＨＳＦｂ分泌ＭＭＰ一１、ＭＭＰ一２活性没有明显作用；血竭素对ＨＳＦｂ 分泌ＭＭＰ—ｌ、ＭＭＰ一２活性有抑制作用，与对照组差异显著（Ｐ（Ｏ．０１）；乳香水提物对ＨＳＦｂ分泌ＭＭＰ一１活性有抑制作用，与对照组差异显著（Ｐ（Ｏ．０１），对ＭＭＰ－２活性略微有抑制作用，但无统计学意义（Ｐ）Ｏ．０５）；三氧化二砷组ＨＳＦｂ分泌ＭＭＰ一１、ｂＩＭＰ一２ 活性明显高于对照组（尺０．０１）。 ２、免疫细胞化学法结果： （１）ＴＩＭＰ一１蛋白主要为胞浆表达。对照组０、６、１２、１８ ｈ，各用药组０ ｈ标 本，胞浆均淡染，ＴＩＭＰ一１表达量较低，经统计上述各组量均无差异（Ｐ＞Ｏ．０５）；水 溶性珍珠粉作用６ ｈ后ＴＩＭＰ一１表达仍较低，作用１２、