基因型鉴定心得.pptx

培训心得之基因型鉴定 刘艺 基因型鉴定基本步骤DNA提取PCR反应 DNA提取所取样本—鼠尾取样时间取样过程动物标记取样记录注意事项取样时间 10d-14d 鼠小，尾尖部DNA充足，出血少，毛少，易操作。 取样过程 器械：眼科剪，小镊子，酒精棉，基因型检测记录表，记号笔，1.5ml EP管（消毒） 减尾长度：1cm左右 小贴士：双人操作，一剪一消毒，两剪同时进行，三序核对，稳准狠 脚标：剪鼠尾的同时，剪去一小段不同脚趾，通过不同脚趾的缺失排布以确定该小鼠的编号。前肢用字母F（front leg）表示(1-8)，后肢用字母R（rear leg）表示(1-10)。思考：第26只小鼠标记是什么？FR动物基因型检测记录表检测鼠ID样品准备的注意事项①鼠尾最好当天剪完当天进行DNA的提取。②如不能提应放至-20℃冰箱保存，但注意冻存时间不宜过长。③低温保存的样品不宜反复冻融。举例：百奥赛图老师们10d剪尾—1周做检测—18d基因型鉴定完毕—分笼DNA提取的总流程 标注序号裂解液的 配制鼠尾裂解 离心去杂质 吸取上层 溶液异丙醇沉淀离心洗涤室温风干水溶DNA裂解液的配方 蛋白酶K（PK）：储存浓度：10mg/ml；终浓度100ug/m; -20℃保存。 储存液可以事先配制好，蛋白酶K要现用现配。 配制列子：10ml裂解液 Tris-HCl 1ml EDTA 100ul NaCl 667ul SDS 200ul 蛋白酶K 100ul 10000ul(10ml)-1967ul=8033ul水提取具体步骤PCR鉴定引物设计条件摸索常见问题举例说明引物设计设计原则①引物长度一般为20~24bp②引物碱基尽可能随机分布：GC含量约60%③引物不应有发夹结构：即不能有4bp以上的回文序列④引物的3‘端为关键碱基：两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列⑤在3’端不应有任何互补碱基⑥产物大小：约200~300bp⑦Tm值：60℃左右⑧特异性：即无目的条带之外的多余条带⑨最理想的鉴定引物，一对引物即可以区分两种基因型条件摸索DNA模板引物Mg2+浓度dNTP MixtureddH2O退火温度温度梯度下如果没有条带，直接换引物吧！常见问题引物是关键： 无扩增产物—引物设计不当或发生降解 非特异性扩增—引物特异性差原因对策重新设计引物吧！模板要干净，浓度要合适 无扩增产物：含量低，含有抑制物（酒精没洗干净） 非特异性扩增：模板浓度过高 拖尾现象：模板不纯 模板在加入MIX之前要测定浓度 OD:260/280 纯DNA浓度OD值大约在1.8原因1.操作时动作要轻柔2.器材要高温高压消毒3.各种试剂事先分装，低温贮存被污染了！！！假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物（水对照，阴性对照）。PCR中对照组的设立Cre-loxp systemFlp-Frt system基因敲进—Rosa 26工具鼠查找使用Cre 一种重组酶，可由噬菌体转染到细胞，催化Loxp位点间的DNA进行特异性重组。Loxp 34bp序列，两端是13bp的反向重复序列，中间是其定向作用的8bp间隔区。重组产物 根据loxp位点的位置和相对方向而不同，在一条链上单loxp位点的DNA将被融合。 LoxpLoxpCreFlp-Frt system:主要用来去除NeoFlpNeoFrtFrtNeo：新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志。LoxpLoxpCreFrtFrtPromotor+Rosa26+geneTargetNeoRosaRosaNeo 后有一个stop序列，所以当Neo存在时，后方的报告基因不表达，Cre敲掉目的基因同时报告基因被敲进。基因敲进—Rosa 26 Rosa 26不编码蛋白质，在其前面加入强启动子，后面加一个过表达的基因便可以实现定点敲进，用于识踪。工具鼠 含有重组酶（Cre,Flp)的小鼠，可与含（Loxp,Frt)小鼠交配，得到基因敲除/敲进小鼠。选择工具鼠： / 有详细的介绍各种工具鼠。 ①工具鼠是B6品系的。 ②Promotor 全身性敲除，特异性敲除，常染色体，性染 色体。 ③工具鼠的纯和程度，概率。 全基因敲除CreLoxpFrtFrtLoxpTarget NeoPCR过程中各种对照组的选择获得全基因敲除/敲进小鼠 ①F1代杂合子小鼠(fl-neo) 直接跟Cre-deleter小鼠交配，从而将exon6和Neo cassette 一起敲除，获得全基因敲除目的基因同时敲进Tdtomato报告基因的小鼠。 ②杂合子小鼠交配获得纯合子。Controls: +/+, Cre/+1. 与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲除/敲进杂合子小鼠Controls: M