解析异位种植结肠癌肝转移.docxVIP

　　结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年超过１００万人诊断为结直肠癌［１］，近年来其发病率在欧洲跃居第１～２位［２］，我国居第４位［３］。 　　影响患者预后的主要问题是肿瘤复发或转移，其中肝脏是结直肠癌血行转移最主要的靶器官［４］。 　　大约２５％的患者在诊断结直肠癌时就已出现肝转移［５、６］。 　　手术切除结直肠肿瘤后仍有大约２０％～５０％的患者出现肝转移，其５年存活率约１０％～５８％［７］。 　　研究和建立结直肠癌肝转移的动物模型，特别是具有高转移率的肝转移动物模型，对研究结直肠癌肝转移的治疗以及抗肿瘤药物的筛选等具有重要意义。 　　结肠癌肝转移种植性动物模型主要有肿瘤细胞原位种植和异位种植，后者主要包括肿瘤细胞肝门静脉注射Ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，脾脏种植Ｉｎｔｒａｓ－ｐｌｅｎｉｃｉｎｊｅｃｔｉｏｎ两种方式。 　　虽然这两种异位种植的?动物模型应用广泛，关于它们形成结肠癌肝转移效率及效果的认识还不统一［８］。 　　早在２０世纪８０年代初就有学者进行研究，迄今为止已有多种结肠癌肝转移异位种植动物模型报道，各具优缺点［９］。 　　本研究对结肠癌异位种植动物模型肝门静脉注射法和脾脏种植法的肝转移率及其效果进行分析比较，为结肠癌肝转移的预防和治疗提供动物模型。 　　１材料与方法１．１实验材料１．１．１实验动物ＢＡＬＢ／ｃ小鼠共６０只，由广西医科大学实验动物中心提供，雌雄各半。 　　体重２０～２５ｇ，周龄６～８周。 　　合格证号ＳＣＸＫ桂２００３－０００３。 　　在ＩＩ级动物实验室饲养。 　　１．１．２实验瘤株ＢＡＬＢ／ｃ小鼠结肠腺癌细胞株ＣＴ２６由美国引进，第二军医大学曹雪涛教授惠赠。 　　常规培养ＣＴ２６细胞于含１０％胎牛血清的ＲＰ－ＭＩ－１６４０营养液。 　　取指数生长期的细胞图１，消化吹打成单细胞悬液，９５２ｇ１０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加适量不含血清的ＲＰＭＩ－１６４０营养液调整细胞浓度至１×１０６个／ｍＬ。 　　图１对数生长期ＣＴ２６细胞１０×１０１．２实验方法１．２．１脾脏种植不保留脾脏法造模３０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠称重后采用腹腔内注射法麻醉，选用０．２％的戊巴比妥钠，剂量控制在４０～５０ｍｇ／ｋｇ，小鼠麻醉成功后固定于手术台上。 　　常规皮肤消毒，取左侧腋中线纵行切口进腹腔，长约１ｃｍ，显露柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用０．２ｍＬ注射器３１Ｇ针头从脾下极进针，注入瘤细胞液０．２ｍＬ。 　　拔针后酒精棉球按压针眼约３ｍｉｎ，促进瘤细胞经脾静脉进入肝脏，查无出血，结扎脾血管及胃短动静脉，切除脾脏，再次查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。 　　术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。 　　１．２．２肝门静脉注射法造模３０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠称重后采用腹腔内注射麻醉，选用０．２％的戊巴比妥钠，剂量控制在４０～５０ｍｇ／ｋｇ，小鼠麻醉成功后固定于手术台上。 　　常规皮肤消毒，取腹正中切口进腹腔，长约１ｃｍ，显露肝门静脉，用０．２ｍＬ注射器３１Ｇ针头从肝门静脉与水平成３０度进针，注入瘤细胞液０．２ｍＬ。 　　拔针后酒精棉球按压针眼约１５ｍｉｎ，查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。 　　术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。 　　１．３观察指标小鼠苏醒后常规饲养，每日观察其饮及活动情况，所有小鼠待其自然死亡，观察生存期。 　　小鼠死亡后均剖腹观察腹腔内肿瘤生长情况，肝转移率及肝脏成瘤情况，肺转移率，切取肝脏转移瘤置于１０％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，ＨＥ染色，进行常规病理组织学观察。 　　１．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行数据分析，卡方检验比较计量资料的组间统计差别，ｔ检验比较计数资料的组间统计差异，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 　　２结果２．１大体观察两组小鼠接种后大体观察相似。 　　术后１０ｄ内ＢＡＬＢ／ｃ小鼠活动如常，体形无明显变化。 　　１０ｄ后个别小鼠开始出现摄食量下降，行动渐迟缓，消瘦，腹部渐膨隆，但尚无小鼠死亡。 　　２０ｄ后小鼠进一步消瘦，腹部膨隆明显，严重者出现死亡，第一只小鼠自然死亡时间出现在肝门静脉注射组术后第２２ｄ。 　　术后第３０～５５ｄ，大部分小鼠死亡，最后一只死亡时间出现在脾脏注射组术后５８ｄ。 　　２．２肝转移率两组分别成功接种３０只小鼠，肝门静脉组２９只有肝转移灶形成，１只未发现肝脏表面及切面转移灶，肝脏转移率为９６．７％。 　　脾脏注射组２４只小鼠发现肝转移灶，肝脏转移率为８０％。 　　两组间差异具有统计学意义Ｐ＝０．０４４，表１。 　　２．３肝转移灶成瘤情况肝转移灶成瘤情况描述为成瘤级别高－转移灶布满全肝；成瘤级别中－转移灶占全肝１／２及以上；成瘤级别低－转移灶占全肝低于１／２。 　　肝门