家蚕虎斑基因(Ze)的定位与表达谱分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

江苏科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于： (1)保密□，在 年解密后适用本授权书。 (2)不保密□。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 摘 摘 要 I I 摘 要 家蚕（Bombyx mori）在中国具有 5000 年的历史，是野桑蚕驯化而来的完全变态 昆虫，不仅是重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式生物。研究家蚕生命过程中的 各种表征、功能基因及其分子机制是对家蚕进行完全利用使其经济利益最大化的重要 前提。另一方面由于家蚕与鳞翅目昆虫具有高度同源性，家蚕在分子水平上的研究成 果也可以作为认识其他重要鳞翅目昆虫的功能性状发生机理提数据来源，为害虫的防 治及种间特异性防治靶点的选择提供新的思路和方法。 家蚕的斑纹是家蚕最直观的的体态特征，且种类繁多。家蚕斑纹的研究不仅可以 了解其在分子水平上的发生机制，在斑纹限性育种，害虫防治方面也有深远的意义。 本实验采用家蚕虎斑斑纹为实验材料，结合应用分子遗传标记技术、HRM 分析技术和 差异基因表达分析等对家蚕虎斑斑纹的精细定位、发生机理和形成机制进行研究。其 研究内容和主要成果如下： 一、家蚕虎斑斑纹基因定位材料的配制 本实验所用家蚕品种为纯合虎斑品系 Zebra 和纯合非虎斑品系 p50，均保存于中国 农业科学院蚕业研究所。虎斑品系 Zebra 的基因型为 ZeZe，p50 的基因型+Ze+Ze，表型 为非虎斑。 利用家蚕雌不交换的特点，由 Zebra 作为母本，p50 品系为父本和回交亲本，组配 BC1M 群体 p50×(Zebra×p50)。收集亲本、F1 及 BC1M 群体中的非虎斑个体为实验材 料，置-25℃低温冰箱保存，以备分子标记多态性筛选和精细定位使用。 二、家蚕虎斑斑纹的精细定位 本研究采用 HRM 分析技术对目标基因 Ze 进行定位分析。利用 479 个 BC1M 非虎 斑表型个体作为作图群体，用筛选得到的 9 个多态性标记（s2924-06、s2924-11、 s2924-08、s2924-60、s2924-03、s2924-01、s2930-09、s2930-16、s2930-22）进行家蚕 虎斑 Ze 基因的定位分析。采用 Mapmaker3.0 作图软件，取重组值（LOD）为 3.0，绘 制出家蚕虎斑基因连锁图，所得到的虎斑基因的连锁图的遗传距离为 10.7cM， 虎斑 位于连锁图谱遗传距离 6.4cM。得到了 2 个与虎斑基因较近的 SSR 标记为 s2924-01、 s2930-09，与 Ze 的距离分别为 1.5cM 和 0.2cM。 三、家蚕虎斑与非虎斑基因的表达谱分析 利用虎斑品系 Zebra 与非虎斑品系大造（p50）作为回交品系构建的近等基因系， 江苏科技大学理学硕士学位论文 江苏科技大学理学硕士学位论文 II II 以此为 3 眠眠中的幼虫体壁为材料，入眠至蜕皮前每个 2h 取材 1 次。分别选择其中虎 斑表型个体和非虎斑个体的第 3、4 腹足中间处截断，去尾部，剩下的体壁作为虎斑体 壁材料和非虎斑体壁材料，抽提总 RNA，委托上海翰宇生物科技有限公司进行 Solexa 数字表达谱测序。测序得到的 reads 的平均长度均为 100 bp。家蚕虎斑材料数据（Reads） 6059501 个，其中有效数据（Clean data）5723324 个。测序得到非虎斑材料数据为 6012510 个，其中有效数据 5654368 个。将虎斑与非虎斑的基因进行表达差异分析， 发现虎斑对非虎斑样品中共有 303 个基因出现了显著差异，其中 189 个为上调差异， 114 个为下调差异。这 303 个显著差异基因中有 83 个基因与家蚕已知功能基因对应。 在 189 个显著下调基因中共有 37 个基因有对应的 KO 分类，下调差异表达基因涉及翻 译、转录、折叠、分拣、碳水化合物代谢、核苷酸代谢等，但较多的差异表达基因未 能在代谢途径中得到注释，所以我们并没有得到家蚕虎斑非虎斑 3 眠期间下调基因的 显著富集的代谢途径；在 114 个显著上调基因中共有 23 个查到了对应的 KO 分类，上 调差异表达基因涉及内分泌和代谢疾病、信号转导、发育等较多，同样由于较多的差 异表达基因没有在代谢途径中得到注释，所以没有得到家蚕虎斑非虎斑 3 眠期间上、 下调基因的显著富集的代谢途径。而后，我们对家蚕斑纹色素形成的相关氨基酸的代 谢通路中的差异基因进