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高效液相色谱仪原理及应用实验指导书 贵州大学精细化工研究开发中心（绿色农药与生物工程重点实验室） 1. 实验类型：设计型实验（研究性实验） 课时安排：6课时 实验目的和意义： 通过学习高效液相色谱仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 4. 实验原理 高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次（103-106）的分配（吸附－脱附－放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。 实验设备 高效液相色谱仪、色谱柱、容量瓶、分析实验室常用玻璃仪器、甲醇等色谱纯试剂，超纯水，滤膜。农药标准品。 6. 实验内容： 了解并初步掌握高效液相色谱仪的基本原理与构造；了解高效液相色谱仪常用的几种检测器工作原理和使用范围；学习高效液相色谱法分离化合物和检测化合物的含量的方法；通过测定对样品的定性、定量测定，初步掌握获得高效液相色谱谱图和数据的一般操作程序与技术；学习样品制备的方法；了解影响分析测定的重要因素，学会优化分析条件；学习谱图和数据的处理方法。 1) 样品制备 样品制备过程中，要同时考虑将被分析的样品中，可能干扰欲测组分定量的物质尽可能的分离出去。当欲测组分含量很低时，还要考虑通过样品制备使欲测组分在试验样品中的含量得以提高，便于进行色谱分析。 2) 定性、定量方法 保留时间定性；峰高、峰面积定量（归一法、外标法、内标法、标准加入法）。 3) 方法可行性的验证 联用技术进一步定性；准确度（添加回收率实验）、精密度实验。 数据处理 实验中所有测量数据都要随时记在专用的记录本上，不可记在其他任何地方，记录的数据不得随意进行涂改；其平行实验数据之间的相对标准偏差（RSD）一般不应大于5%；实验结果的误差应不超过±2%。 5) 仪器操作 a. 开机，启动装置，进入Win2000；开启LC，点击Instrumentl online图标，进入仪器控制面板，设置所需各项参数。 b. 设置分析用流动相清洗流路,等待色谱柱、系统的平衡，基线稳定，开始进样分析。 c. 分析结束，数据处理，打印报告。 d. 关闭柱温箱和检测器，冲洗色谱柱，关闭脱气机、泵，关闭整个装置。 e. 关闭总电源。 f. 在记录本上记录使用情况。 7. 注意事项 1) 实验之前必须交预习报告，实验完后每人写一份实验报告。 2) 严格遵守实验室规章制度。 3) 做好实验记录工作。 8. 思考题 1) 通过对方法准确度和精密度的考察，说明方法的可行性。 2) 高效液相色谱仪的日常维护及其必要性。 附：参考实验实例 农药制剂的高效液相色谱分析 ?? 一、目的要求 1、了解高效液相色谱仪和二极管阵列检测器(DAD)的使用范围、原理和使用方法。 2、掌握高效液相色谱含量测定方法和方法学的考察。 3、本方法的适用性，适用于生产过程和实验过程中中间体和产物含量跟 二、基本原理 ? 大部分的农药能在紫外可见光区有吸收，因此选择高效液相色谱（配DAD检测器）对上述两种化合物进行分离，定性定量测定。 ????三、仪器与试剂 ?仪器：高效液相色谱仪（配DAD检测器）；C18反相柱；容量瓶。 ??试剂：甲醇（色谱纯），超纯水，滤膜。农药标准品。 四、试验步骤 1. 色谱条件：色谱柱，Eclipse XDB反相柱（4.6×150 mm i.d.）；流动相，甲醇：水（70: 30, v/v），检测波长，212 nm；流速，1 mL/min；柱温，25? 2. 标准溶液的配制 准确称取一定量的农药标准品，置于25ml容量瓶中，用流动相溶解，定容，配制成标准溶液。 3. 样品的配制 准确称取一定量的农药制剂样品 (精确至0.000l g 置于25 m 五、方法学考察 1. 线性相关性测定 配制 6个不同浓度标准品溶液，分别进样分析，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标作图，检测方法的线性范围和相关性。 2. 方法的精密度 在要求的色谱条件下，对同一样品分别称取4个样进行定量分析，计算含量，变异系数以及标准偏差。 3. 方法的准确度 采用标准添加法，在已知含量的样品中滴加一定量标准溶液，在要求的色谱条件下进行测定，检