光学滤光片适用于基于激光的荧光显微镜-Semrock-滤光片.PDF

Semrock 技术文档系列 光学滤光片 适用于基于激光的荧光显微镜 Neil Anderson, Ph.D., Prashant Prabhat, Ph.D., Turan Erdogan, Ph.d. 适用于激光荧光显微镜的光学滤光片 介绍 因为激光具有高亮度、稳定、长寿命及谱线窄等特性，它正逐渐取代了荧光成像应用中的传统宽带 光源。在成像应用中，激光的上述特性可提高可视化的灵敏度，也增加了光通量；激光更具有光束发散 角窄、高度的时空相干性、偏振特性明确等独有特性，从而催生了众多新的荧光成像技术。然而，相对 于宽带光源，当激光以荧光光源的形式出现时，为基于激光的成像系统（如共聚焦和全内反射荧光（TIRF） 显微镜）及其组件提出了新的限制要求。尤其是对光学滤光片有着更特殊的要求。 针对激光光源进行优化的光学滤光片 在过去四十多年里，已开发出了许多强大、高效且性价比好的激光器。人们通常按增益介质和激励 方式对激光器进行分类。至今，最受欢迎的用于荧光成像的激光器仍为气体激光器 （如氩离子和氪离子 激光器）最常用的激光谱线为488、568和647nm。但在最近几年，由于固态激光器的（电光转换）效率明 显更高（产生的热量更低，实验室安装更加简单）、尺寸更小，且成本更低，因此正在逐渐取代了体激 光器。比较流行的激光器类型包括半导体二极管激光器（尤其是405和635nm）、光泵浦半导体激光器（包 括广泛使用的488nm），以及倍频二极管泵浦固态（DPSS）激光器（包括561nm的黄光激光器和较新的515nm 和594nm激光器）。表1总结了在荧光成像应用中最受欢迎的激光器。 激发滤光片：尽管尚有异议，但针对激光光源的消杂滤光片（激发滤光片）是十分重要的，可用它 阻挡不想要的非激光线波长的光，包括固态激光器中自发发射和气体激光器的等离子线。这些滤光片不 仅要能够滤掉的无用光（ OD 6），对于激光线也应具有高透过率（T95%） （请参见图1和3）。此外， 这些滤光片还要耐用，以承受高强度的激光束的照射。 与沿用了几十年的传统软镀膜的荧光滤光片不同，通过离子束溅射制作的新型硬镀膜的薄膜滤光片 具有很高的激光损伤阈值（LDT）等级。Semrock 生产的的激光滤光片通常具有 1 焦耳/平方厘米或更高 的LDT 等级，适用于强脉冲激光。对于连续 （CW）激光器，该LDT 等级相当于 10-100千瓦/平方厘米。 此外，硬镀膜滤光片几乎不受温度和湿度引起的环境退化的影响；由于具有高光学耐久性以及稳固的环 境可靠性，在大多数荧光显微镜应用中无需更换滤光片。 表1：常用荧光激光器 “DPSS”= 二极管泵浦固态激光器 “OPS”= 光泵浦半导体激光器 “倍频”= 通过非线性光学晶体实现倍频 激光谱线 激光器类型 常用荧光 TM ~405nm 二极管 DAPI、Hoechst、Alexa Fluor 405 、BFP ~440nm 二极管 473nm 倍频DPSS 488.0nm 氩离子气体 GFP、FITC、Alexa Fluor 488TM ~ 488nm 倍频OPS YFP、Rhodamine 514.5nm 氩离子气体 515.0nm 倍频DPSS 561.4nm 倍频DPSS TM TRITC、Cy3 、RFP 568.2nm 氪离子气体