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蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析;Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析;Western Blot 简介：;Western Blot 基本原理;Western Blot 优点;Western Blot应用;Western Blot 流程;通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白;蛋白样品的定量;蛋白样品的变性;SDS：;蛋白质-SDS胶束的特点：;不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 ;SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。;凝胶成分;PAGE：聚丙烯酰胺凝胶;聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：;凝胶浓度与蛋白分离范围;不连续电泳：;灌制分离胶 隔绝空气;灌制积层胶 插入梳子 ;;转膜;转移膜的选择;湿转系统;半干转移系统;丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 ;封闭;一抗、二抗孵育;二抗与底物反应显色;膜解吸方法（膜的重复利用） ;Western Blot结果分析;Western Blot常见问题分析;SDS电泳;条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？;转膜及抗体检测;转移到膜上的蛋白很少;膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高;杂交信号很弱;一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合;Further Readings;谢谢大家！;;PPT模板下载：/moban/ 行业PPT模板：/hangye/ 节日PPT模板：/jieri/ PPT素材下载：/sucai/ PPT背景图片：/beijing/ PPT图表下载：/tubiao/ 优秀PPT下载：/xiazai/ PPT教程： /powerpoint/ Word教程： /word/ Excel教程：/excel/ 资料下载：/ziliao/ PPT课件下载：/kejian/ 范文下载：/fanwen/ 试卷下载：/shiti/ 教案下载：/jiaoan/ PPT论坛： ;PPT模板下载：/moban/ 行业PPT模板：/hangye/ 节日PPT模板：/jieri/ PPT素材下载：/sucai/ PPT背景图片：/beijing/ PPT图表下载：/tubiao/ 优秀PPT下载：/xiazai/ PPT教程： /powerpoint/ Word教程： /word/ Excel教程：/excel/ 资料下载：/ziliao/ PPT课件下载：/kejian/ 范文下载：/fanwen/ 试卷下载：/shiti/ 教案下载：/jiaoan/ PPT论坛： ;研究背景;研究背景;PART TWO;基本概念;基本概念;PART THREE;理论研究;理论研究;PART FOUR;试验方法;试验方法;试验方法;PART FIVE;实际应用;;PART SIX;未来展望;