甲拌磷急性中毒相关基因在大鼠脏器的表达研究-法医学专业论文.docxVIP

山西 山西医科大学硕士学位论文 I I 甲拌磷急性中毒相关基因在大鼠脏器的表达研究 摘 要 目的： 应用实时荧光定量 PCR（RT-PCR）技术检测大鼠脏器中（心、肝、肺、脑和 肠）甲拌磷中毒相关基因（AChE、BChE、PON-1 和 FOS）mRNA 的表达，筛选出 表达变化有统计学意义的脏器和中毒相关基因；检测中毒相关基因在中毒致死大鼠 脏器中的 mRNA 表达量，探讨甲拌磷中毒相关基因 mRNA 表达变化在中毒死亡时 间推断的可行性，在法医学中为甲拌磷中毒死亡时间的推断提供科学的依据。 方法： 健康成年雌性 SD 大鼠 24 只，随机分为空白对照组、急性中毒死亡组、中毒死 亡 1d 组和中毒死亡 7d 组。急性中毒死亡组、中毒死亡 1d 组和中毒死亡 7d 组分别 用 3LD50 的甲拌磷对大鼠进行灌胃，死亡后分别立即解剖取心、肝、肺、脑和肠， 放置 1d 后解剖取肝脏和放置 7d 后解剖取肝脏。空白对照组用同样体积的生理盐水 对大鼠进行灌胃，乙醚麻醉后立即解剖取心、肝、肺、脑和肠，实验组和空白对照 组所取样本重量均约为 30mg，取材后立即置于液氮中保存待检。各样本用 TRIzol 总 RNA 提取试剂 TRIzol Reagent 提取总 RNA，1%非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分 光光度计分别检测总 RNA 纯度、浓度及其完整性，以β-actin 作为内参基因，将 总 RNA 逆转录合成 cDNA，梯度浓度稀释 cDNA 原液，分别建立 AChE、BChE、 PON-1、FOS 和β-actin 的相对定量标准曲线； SYBR Green I 嵌合荧光法实时定量 PCR 技术检测各目的基因 mRNA 相对表达量，进行统计学分析，研究其在中毒致 死大鼠脏器表达量的变化。 结果： 提取的总 RNA 经 1%非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测纯度、 浓度及其完整性较好，均可满足后续实验要求。 内参基因β-actin 与目的基因 AChE、BChE、PON-1 和 FOS 的扩增效率分别 为 109.2％、100.9％、108.7％、105.3％和 100.91％，一致性较好，说明内参基因 I II 选择正确；扩增曲线为光滑的 S 型曲线，基线较平，拐点清楚，平台期平行性较好， 说明反应过程良好，没有非特异性产物出现，引物设计良好且特异性强；β-actin 基 因熔解温度为 85°C，AChE、BChE、PON-1 和 FOS 基因熔解温度分别为 87.5° C、82.5℃、81.5℃和 89℃，熔解曲线是单一的较高的尖峰，底部平而窄，无杂峰 出现，说明这些基因扩增的特异性较强，没有引物二聚体的出现。 急性中毒死亡组目的基因 AChE、BChE、PON-1 和 FOSmRNA 在大鼠心脏中 表达分别为空白对照组的 8.79 倍（P0.05）、1.86 倍(P0.05)、45.64％(P0.05)和 1.15 倍(P0.05)；肝脏中分别为空白对照组的 8.59 倍（P0.05）、1.89 倍（P0.05）、1.09 倍（P0.05）和 3.60 倍（P0.05）；肺中分别为空白对照组的 5.44％（P0.05）、67.00％ (P0.05)、1.11 倍(P0.05)和 3.99 倍(P0.05)；脑中分别为空白对照组的 10.69％ （P0.05）、92.54％(P0.05)、2.12 倍(P0.05)和 13.91％(P0.05)；肠中分别为空白 对照组的 8.01％（P0.05）、1.08 倍(P0.05)、0.84％(P0.05)和 49.86％(P0.05)。 中毒死亡 1d 组目的基因 AChE、BChE、PON-1 和 FOSmRNA 在大鼠肝脏中表 达分别为空白对照组的 53.92 倍（P0.05）、33.64％(P0.05)、46.25％(P0.05)和 1.33 倍(P0.05) ；中毒死亡 1d 组各目的基因 mRNA 在大鼠肝脏中表达分别为急性中毒 死亡组的 6.27 倍（P0.05）、17.80％(P0.05)、42.43％(P0.05)和 37.02％(P0.05)。 中毒死亡 7d 组肝脏中提取的总 RNA 经 1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测发现已 无明显的条带（18S 和 28S），逆转录经 RT-PCR 扩增后也无明显的 S 型扩增曲线， 说明 7d 后各基因的总 RNA 已降解，可认为其表达量为 0。 结论： 除了 PON-1 基因以外，肝脏中 AChE、BChE 和 FOS 基因 mRNA 的表达均有 统计学意义，可以作为甲拌磷急性中毒相关基因表达研究的靶器官；BChE 基因在 心脏和肝脏中表达稳定且有统计学意义，可以作为甲拌磷急性中毒的基因表