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分子生物学实验流程及相关试剂、仪器概述 GENE COMPANY LTD 2003年8月 For 江西日博公司 分子生物学实验概述 分子生物学实验概述（续） 分子生物学主要实验流程 实验起始材料的选取和准备 mRNA的提取、纯化 目标片段的克隆和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 基因转化实验及转基因结果分析 实验起始材料的选取和准备 实验起始材料的选取和准备 卵细胞mRNA的提取、纯化 目标片段的克隆和分析 利用SMART cDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库 目标基因的获得 通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序 通过SMART技术构建cDNA文库 目标基因的克隆 利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选 利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因 通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因 通过核酸杂交和免疫反应筛库 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性） 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交 利用PCR技术获得目标基因 利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测 利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测 DNA、RNA的提取、纯化和分析 包含有目标基因的质粒的获得 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析 包含有目标基因的质粒的获得 对于通过筛库技术获得的目标基因 通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒 对于通过PCR技术获得的目标基因 通过回收纯化后利用T载体等克隆并转化细菌 铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个菌落 对于通过PCR技术获得的目标基因 对于通过PCR技术获得的目标基因 对于通过PCR技术获得的目标基因（续） 质粒提取、分析 常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA 质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA 质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切 电泳，用凝胶成像系统分析 测序 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA 利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA 水稻基因组文库的构建 利用特异的探针，通过Southern blotting检测目标基因的拷贝数 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析 分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA 在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量 利用特异性的探针，通过Northern blotting检测目标基因在各器官的表达情况 Southern blotting和Northern blotting Southern blotting和Northern blotting（续） 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 克隆化基因的表达 表达蛋白的纯化 功能分析 克隆化基因的表达 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证） 体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达 体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等 表达蛋白的纯化 SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白。 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白，利用亲和层析洗脱出目标蛋白 自动核酸/蛋白纯化工作站 目标蛋白功能分析 抗体的制备：多抗、单抗 DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交