酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算.pdfVIP

酶动力参数 Km、V max 和 Kcat 值的计算（以日立 U3010 为例） 强玮 2014-3-31 一、 Km 根据酶促反应方程，即米 -曼式氏方程（ Michaelis-Menten equation ）： V =(VmaxS)/(Km + S) 当 v=0.5Vmax 时， Km=[S] ，可见 Km 等于酶促反应的初速率为最大速率 Vmax 一半时的底 物浓度。 Km 值一般在 10-6~10-2 mol/L 之间，单位一般为 mM 或者 uM 。Km 只与酶的性质有 关，而与酶的浓度无关。 由于 Km 值与酶的浓度无关， 所以计算时无需对蛋白进行定量， 理论上诱导破碎的菌体 上清（粗酶液） 即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在 稍微好一点的 SCI 杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不 同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程 （Michaelis-Menten equation V =(VmaxS)/(Km + S) ） 进行非线性回归（ nonlinear regression ），拟合的方程中就给出了计算出的 Km 值。 非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽 量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域， 以下图为例， 酶反应速度遵循米氏方程的规律， 先是一级反应， 速度随底物浓度上升也直线上升， 然后是混合级反应， 趋于平缓， 最后进入 零级反应， 反应速度不再随浓度上升而上升， 而是趋于一个稳定的值。 根据这个规律， 具体 梯度测试时， 底物浓度的选点很重要， 要根据实时测得的斜率或活度值实时调整， 尽量要覆 盖这三个区域， 这样回归拟合出来的米氏方程才是准确的， 计算出的酶动力参数才是正确的。 初速 度 Hill Fit of 初速 度 0.3 度 0.2 速 初 0.1 0.0 0 20 40 底物浓度 (mM) 用于非线性回归分析的软件很多， Origin 8.0 我比较喜欢，将酶活数据输入后，全选， “Analysis ”菜单下选择“ Fitting ”，进一步选择“ Nonlinear curve fit ”进入对话框，在函数 归类框“ Category ”中选址“ Growth/Sigmoidal ”类函数，接着在子函数框“ Function ”中选 择“ Hill ”函数。由于 Origin 8.0 中没有保存米氏函数，但是