PCR和实时荧光定量PCR简要介绍.pptVIP

PCR和实时荧光定量PCR简介 PCR的定义 PCR Polymerase Chain Reaction，即“聚合酶链反应”，它是指在DNA聚合酶的催化作用下，以母链DNA为模板，通过变性、退火、延伸，复制出与模板DNA互补的子链DNA的过程。 PCR的准备 引物的设计 模板的制备 引物的设计原则 1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C 3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。 引物的设计原则 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 模板的制备 （一）DNA模板制备 去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸 水煮沸溶解细胞 要求并不严格 模板用量低，哺乳动物基因组DNA1μg，质粒DNA0.1ng PCR产物的积累规律 PCR产物的积累规律示意图 PCR反应条件 一、反应体系 标准PCR反应体积为50~100μl,其中含有缓冲液，4种底物，引物，DNA模板和耐热DNA聚合酶。 二、反应步骤 加入各种试剂，95C热变性5~10分钟，使模板DNA充分变性，同时除去蛋白酶，氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入2U TaqDNA聚合酶，加50μl液体石蜡封盖反应体系，防止液体挥发。进行PCR反应。(如有热盖设计的PCR仪则不需要加入液体石蜡) 三、循环参数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94 ℃ ，1min；95 ℃ ，30 s ；97 ℃ ，15 s ； 退火温度和时间：45~55 ℃ ，30s~1min 延伸温度和时间：72 ℃ ，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min 循环次数：25~30次，视最初靶分子浓度而定 两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步PCR 四、反应缓冲液 10~50mmol/L Tris-HCl 缓冲液，72℃ 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 镁离子浓度：常用1.5mmol/L 五、底物浓度：20~200μmol/L 六、TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。 七、引物：0.1~0.5 μmol/L PCR 反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。 八、模板：0.1~0.5 μmol/L 在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102?105拷贝的待扩增片段作为模板。 PCR产物的检