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rna提取方法,总结 　　血液RNA提取方法　　1.取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。　　2.彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。　　3.每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。室温放置5min，使样品充分裂解。　　4.4℃12,000rpm离心10分钟，取上清。　　5.每1mlTRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min，自然分相。6.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中7.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。　　8.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。　　9.RNA沉淀中加入1ml75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。　　10.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清。　　11.室温放置1-2分钟晾干沉淀。　　12.沉淀中加入50-100μlRNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。　　13.检测纯度和浓度　　RNA提取方法　　1、在超净工作台中取500uL裂解液RLT加入到的离心管中，加入5uLβ-巯基乙醇，60uLPLANTaid混匀备用；　　2、在95%乙醇擦过的桌面上用液氮研磨适量植物组织，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管中，立即剧烈震荡2-3min充分裂解，将裂解物13000rpm常温离心10min。　　3、在新的离心管中加入新开封的无水乙醇250uL，按1:2的比例加入上清液500uL，用移液枪慢慢混匀，13000rpm常温离心60s。　　4、每个吸附柱RA中加入750~800uL的上清液，静置后13000rpm常温离心1min，弃废液。可以2管或3管合并到一个吸附柱RA中。　　5、向吸附柱RA中加入350~400uL的去蛋白液RWL，放置5min，1XXrpm常温离心30~60s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。　　6、向吸附柱RA膜中央加入50uLDNaseI工作液，37℃烘箱放置30min。　　7、向吸附柱RA中加入350~400uL的去蛋白液RWL，放置5min，1XXrpm常温离心30~60s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。该步骤可再重复一次。　　8、加入漂洗液RW500uL，静置后1XXrpm常温离心30s，弃掉废液；加入500uL漂洗液RW，重复一次。　　9、将吸附柱RA放回空收集管中，1XXrpm常温离心30s，尽　　量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。　　10、取出吸附柱RA，放入一个新的RNasefree离心管中，加入25uL灭菌后的RNasefreewater，室温放置2min，1XXrpm常温离心1min；将试管中的溶液吸出后再次加到吸附柱中，室温放置2min，1XXrpm常温离心1min。　　11、提取的RNA放置在冰上，取3uL进行电泳检测。3uLRNA+57uL水　　A260/A280介于之间；　　A260/A230要大于　　反转录　　把RNA在65℃条件下放置5min，立即置于冰上。　　反应液的配置：Nuclease-freeWaterupto10uL5×RTBuffer2uLRTEnzymeMixMix1ug反应条件：37℃15min；98℃5min；4℃forever　　反应结束后-20℃保存　　氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。　　异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。　　氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚，苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质，起到一定除杂作用。　　通常氯仿里面会加少量异戊醇，减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。　　异丙醇是沉淀核酸用的，作用和