AccQ-Tag法测氨基酸含量SOP.docVIP

AccQ-Tag法测氨基酸含量 所需设备及试剂 设备： 天平（精度0.1mg）； pH计（精度0.01级）； 单标线吸管（50ml）； 容量瓶（500ml）； 溶剂过滤器及滤膜（0.45μm）； 试管（1.5×15cm，1.5×10cm）； 样品管（6×50mm）； 微量进样器（10μl）； 微量可调移液器（20μl，100μl，1000μl）及吸头； 旋涡混匀器； 烘箱（55℃ HPLC系统及AccQ-Tag柱。 试剂： 超纯水（≥18MΩ?cm）； 乙腈（HPLC级）； Waters AccQ-Tag流动相A浓液 Waters氨基酸水解液标准（H）； Waters AccQ-Fluor试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B）。 流动相A制备：吸取50ml Waters AccQ-Tag流动相A浓液，放至500ml容量瓶中，加超纯水至刻度，用0.45μm滤膜过滤后备用。 衍生 标定标准制备 1mmol/L色氨酸标准液：称取色氨酸（生化试剂）20.4mg，加超纯水溶解至100ml。 含色氨酸的标定标准：取1支Waters氨基酸水解液标准，打开后吸取1ml，放至一支干净的1.5×15cm试管中，加2.5ml色氨酸标准液，6.5ml超纯水，旋涡混匀，每支Eppendorf管分装1ml备用。（此标准含有的色氨酸的浓度与其它氨基酸一样，为0.25mmol/L。） 10倍稀释后的标准可在 –20℃保存1个月。剩余的氨基酸水解液标准可在 –20℃保存3个月。未启封的氨基酸水解液标准可在4℃保存1年。使用 衍生试剂制备 将烘箱预热至55±1℃ 取一瓶衍生剂粉2A，轻轻敲动以确保打开前所有粉末落在瓶底； 吸取1ml稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头；（警告：稀释液2B为乙腈，可燃且有毒，参考安全数据表。） 移1ml稀释液2B至2A瓶中，盖紧瓶盖，旋涡混匀10秒种； 55℃加热5~10分钟使衍生剂粉溶解（加热不得超过10 将溶解后的衍生试剂放入干燥器中，可在室温保存1星期。（注意：衍生试剂遇空气中水蒸气易分解。不用时应密封。） 衍生标准 将烘箱预热至55±1℃ 用微量进样器吸取10μl标定标准至一支干净的样品管底部； 移70μl硼酸缓冲液至样品管中，短暂旋涡混匀； 移20μl衍生试剂至样品管中，立即旋涡混匀数秒种； 室温放置1分钟； 用封口膜封口，55℃加热5分钟（加热使少量的酪氨酸副产物转化为主要的单衍生化合物）。衍生产物可在室温保存1 衍生样品：一般样品稀释60倍，取10μl按3.3.2以下同法操作。衍生应与标准同时进行。 色谱条件 色谱柱：AccQ-Tag氨基酸分析柱（3.9×150mm，4μm）（柱体积：1.8ml） 流动相A：见2.，B：乙腈，C：超纯水 梯度表： T(min) A% B% C% Curve 00 100.0 0.0 0.0 6 17 91.0 5.4 3.6 6 24 80.0 17.0 3.0 6 32 68.0 20.0 12.0 6 34 68.0 20.0 12.0 6 35 0.0 60.0 40.0 6 37 0.0 60.0 40.0 6 38 100.0 0.0 0.0 6 45 100.0 0.0 0.0 6 流　速：1.0ml/min 柱　温：37 紫外检测波长：248nm 进样量：5μl 记录时间：45min 测定 平衡系统 设柱温37℃，流速1ml/min 如果以前柱用100%乙腈保存，先用乙腈/水（60:40）冲洗5min；如果以前柱用60%乙腈保存，接下一步； 用100% AccQ-Tag流动相A平衡柱10min； 运行一次空白梯度（二次更好）。 进样：先进标准，后进样品。上次样品走完与下次进样之间相隔应不超过3min。 冲洗 进样记录完毕后，关闭检测器，继续以100% AccQ-Tag流动相A冲洗10min； 换100%水冲洗40min以上； 如果保存时间为3天或更少时，可用乙腈/水（60:40）冲洗20min；如果保存时间超过3天或不能确定时，用100%乙腈冲洗20min。 分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。 附录 流动相A配制方法 试剂：三水乙酸钠(GR)、磷酸(AR)、乙二胺四乙酸二钠(AR)、叠氮钠(AR)、三乙胺(AR)。 稀磷酸制备：取100ml浓磷酸加到100ml超纯水中。 EDTA溶液制备：称100mg乙二胺四乙酸二钠，加100ml超纯水，超声振荡使其溶解。 流动相A（140mmol/L乙酸钠，17mmol/L三乙胺，pH4.95）制备见下表。（pH一定要准确至0.01） 流动相A 浓A液 1．称19.04g三水乙酸钠 1．称190.4g三水乙酸钠 2．加1L超纯水，搅拌溶解 2．加1L超纯水，搅拌溶解 3．用稀磷酸调pH至5.2 3