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PCR扩增目的基因 薛亚男 生药0911 目录 实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 注意事项 一 实验目的 1、掌握PCR扩增DNA的技术原理 2、学习PCR扩增仪的使用方法 二 实验原理 PCR是一项特异性DNA序列的体外酶促合成方法，是利用2个寡聚合苷酸作为引物与对应DNA链的目的区域的侧翼杂交，经过模板变性作用，引物退火和耐热DNA聚合酶促引物延伸，周而复始地复制产生特定片段，使其在数量上呈指数增加。 三 实验器材 仪器： PCR扩增仪、台式高速离心机、微量移液器、经高压灭菌后的Eppendorf管 材料与试剂： 1）模板DNA（0.1μg/μL）：用牙签挑取单菌落悬浮到 50μL的裂解液中（裂解液1%TritonX-100,20mmol/L Tris-HCL Ph8.2,2mmol/EDTA)，95℃温水浴10min，10000rpm 5min，取2μL上清液用于总体积50μL的PCR反应。 2）TaqDNA聚合酶（5U/μL），10×扩增缓冲液dNTP(1mmol/L) 3）引物（100pmol/L）设计并合成与目的DNA互补的引物。 四 实验步骤 1、PCR反应溶液的准备 1）按以下次序：将下列成分在0.5mL灭菌Eppendorf管内混合：10×扩增缓冲液10μL；4×dNTP s（包括4种dDTP）8μL；引物11μL；引物21μL；模板DNA1μL（10ng）；TaqDNA聚合酶1μL（2.5U）；加水至终体积100μL。 2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2s以集中溶液于管底。 3）加石蜡油50μL封住溶液表面。 2、PCR扩增反应 将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内，95℃ 5min，使模板DNA完全变性。然后按95℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环，30次，循环结束后72℃延伸8min。反应完毕，将样品取出置-4℃待用。 3、实验结果 取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，观察DNA条带。 五 注意事项 1）PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整镁离子浓度等。 2）PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和d NTP的量不易过多。 3）加入反应成分及聚合酶后都要充分混匀体系并用离心机轻甩一次。 * *