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western印迹,实验报告 　　Western印迹法　　这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。　　仪器：高压锅、电动匀浆机、高速离心机、垂直板电泳转移装置、脱色摇床。　　试剂：单去污剂裂解液、分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体、ECL化学发光试剂。　　杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，口罩，保鲜膜，X-光片夹，X-光片，计时器，吸水纸。　　试剂配制：母液　　/ml(200mmol/L)PMSFPMSF异丙醇10ml溶解后，－20℃保存。10％SDS　　SDS5g蒸馏水至50ml　　50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。　　5mol/LNaF氟化钠　　氟化钠超纯水10ml溶解后，-20℃保存。100mmol/L激活矾酸钠　　偏矾酸钠超纯水8ml　　加浓盐酸调节pH至10，80℃左右热水浴至溶液无色，室温冷却，重调pH至10，重复热水浴和调整pH的操作至溶液保持无色，定容10ml，-20℃保存。/LTris?HCl　　Tris()超纯水8ml　　溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。　　10％过硫酸胺　　过硫酸胺超纯水溶解后，4℃保存，保存时间为2周。/LTris?HCl　　Tris()超纯水200ml　　溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。　　/LTris?HCl　　Tris()超纯水8ml　　溶解后，用浓盐酸调pH至，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。30％Acr/Bic　　丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺超纯水至50ml　　37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。　　20％Tween20TweenXXml蒸馏水至50ml　　Tween20比较粘稠，需将大枪头前端剪掉，将吸口扩大，吸取和移液时应缓慢，避免液体挂壁，混匀后4℃保存。　　使用液　　单去污剂裂解液：　　1mol/LTris?10%SDS200mmol/LPMSF蒸馏水至50ml　　若检测磷酸化蛋白，需加入100ul5mol/LNaF和500ul100mmol/L激活矾酸钠，混匀后，4℃保存。　　G250考马斯亮蓝溶液考马斯亮蓝G250：甲醇：15ml乙酸：5ml蒸馏水至50ml溶解后，4℃保存。分离胶　　8％10%超纯水　　30％Acr/　　mol/LTris?HCl　　10％SDS100μl100μl10%AP100μl100μlTEMED4μl　　4μl　　加TEMED后，立即混匀即可灌胶。4％浓缩胶　　超纯水30％Acr/Bic　　mol/LTris?HCl10％SDS30μl10%AP30μl　　12%　　　　100μl100μl　　4μl　　15%　　100μl100μl　　4μl　　TEMED3l加TEMED后，立即混匀即可灌胶。　　还原型5XSDS上样缓冲液　　mol/LTris?HCl二硫叔糖醇10%溴酚蓝甘油混匀后，分装于离心管中，4℃保存。　　电泳液缓冲液Tris甘氨酸蒸馏水至500ml　　溶解后室温保存，次溶液可重复使用2～3次。　　转移缓冲液甘氨酸Tris甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用2～3次。　　Western印迹法　　这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。　　原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成