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nf-kb荧光素酶报告基因 　　荧光素酶报告基因检测　　?原则　　荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下：　　1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。　　2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中。　　3)加入含有所有酶反应成分，使化学发光反应开始。　　4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。　　?特点　　?敏感度和检测范围：5fg荧光素酶　　?发射光的线性范围：10fg—10ng　　?确切的检测限依检测仪器而定。　　?特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶　　基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。　　?器材和试剂　　?器材　　在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。　　?试剂　　1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些　　试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~-25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。　　2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。　　?基本操作步骤　　下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。　　1)将荧光素酶报告基因与?-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。　　2)彻底吸去培养皿中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液　　小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl100g，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，用三蒸水定容至1000ml。　　3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60mm的培养皿用360?l裂　　解液，35毫米的培养板用150?l裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT　　4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另　　一个微量离心管中，置于冰上以备分析。　　5)在开始化学发光反应之前，将100?l的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测　　器皿中。加入360?l荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m　　mol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，2mmol/LATP，1mmol/LDTT　　6)用25mmol/L的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素至200?mol/L。荧光素贮液：1mmol/LD-　　荧光素，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，10mmol/LDTT。　　7)样品中加入200?l稀释的荧光素液。荧光素在光照下迅速发生氧化，因此丢弃未用完的荧光　　素稀释液。在562nm条件下进行检测。　　?注意事项：　　1)荧光素酶检测试剂需在15-25℃的条件预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手　　动检测。当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。.加入荧光素酶检测试剂秒内开始检测发射光1-5秒，持续发光20秒后，产生光强度降低，其半衰期为5分钟。2)如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5个小时，在-70℃可　　保存数月。　　3)利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。　　4)在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围，可用裂解液将样品进行　　稀释。　　5)我们建议不要储存稀释过的样品。如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.　　5mg/mL，这样可以保持样品的稳定性。　　6)如果样品中的荧光素酶的活性较高，应尽可能减少所用来检测的样品的体积。在这种情况下，　　按照标准操作，可以相应减少所使用的荧光素酶检测试剂，这样对检测结果没有影响。　　7)一些荧光仪在进行检测前需要1-2秒的稳定，因此，我们建议在开机后过一段时间再进行检测　　操作。　　8)有一些荧光仪需要在不改变样品体积的条件下加入更多的检测试剂,这与所给定的　　标准的操作有所不同。　　9)如果用液闪计数仪，要逐个加入检测试剂后逐个立即检测。　　荧光素酶报告基因检测结果需要用?-gal进行校正，既荧光素酶报告基因检测结果　　荧光素酶及其报告基因的应用和检测　　一生物