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elisa双抗体夹心法实验报告 　　ELISA双抗体夹心法　　点击次数：　　1、原理　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。　　2、特点　　某些分泌型蛋白，用siRNA干扰后可以用ELISA进行检测。　　3、ELISA实验流程示图320作者：百奥迈科发表于：XX-03-1316:18转载请注明来自丁香园　　4、试剂与耗材　　包被缓冲液：　　洗涤缓冲液：　　稀释液：　　终止液：　　底物缓冲液：　　四甲基联苯胺使用液：　　2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺使用液：　　抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。　　标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。　　96孔聚苯乙烯塑料板。　　2、实验步骤：　　包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/mL。在酶标板反应孔中加mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。　　加样：加一定浓度稀释的待检样品mL于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃，1hr。用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。　　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体。37℃，-1hr，用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。　　加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB底物溶液mL，37℃，10-30min。　　终止反应：于各反应孔中加入终止液mL。　　结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450nm，读数，输出到Excel中。　　以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。　　Elisa实验报告　　实验名称：　　酶联免疫吸附剂测定　　实验原理：　　酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。　　实验材料与试剂：　　1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板,96孔)。2．酶联免疫检测仪。　　3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。　　4．包被液：/L碳酸缓冲液：Na2CO3,　　NaHCO3，　　蒸馏水稀释至100ml。5．稀释液：NaCl8g,，KH2PO4,　　Na2HPO4·12H2O,Tween-20，，蒸馏水加至1000ml。6．洗涤液：同稀释液。　　7．封闭液：%BSA。8．邻苯二胺溶液(底物)：配制：　　/L柠檬酸(/100ml),取，　　/LNa2HPO4·12H2O(/100ml),取,加蒸馏水,　　取邻苯二胺8mg；　　临用前加30%H2O240μl。9．终止液：2mol/LH2SO4。　　实验步骤：　　１．包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释,一般为1~10μg/孔，每孔加200μl,37℃温育30min。　　２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。　　３．加封闭液200μl，37℃温育30min。４．洗涤同2。　　５．加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。同时作稀释液对照。37℃温育30min。６．洗涤同2。　　７．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200μl,37℃温育30min。８．洗涤同2。　　９．加底物：邻苯二胺溶液加200μl，室温暗处5min。１０．加终止液：每孔50μl。　　１１．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。　　实验结果　　数据如下：　　实验讨论：　　1无一抗数据值存在异常。理论上应趋近于零。可能是由于受污染所致实验现象比较清晰，随浓度由浓到稀，颜色由深黄渐变为浅黄。　　2线性关系比较明显。但斜率随浓度减小而有所增大。这可能是在使用取液器时有气泡混入，导致实际浓度低于理论上的浓度。3组号中3个样本数据差别较大，可能是因为配血清时混合不够均匀所致。　　这个实验采用了间接法测定，利用酶的催化放大作用提高了检