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t淋巴细胞转化实验报告 　　猪淋巴细胞转化实验　　1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂，每个样品无菌采血5-8ml。　　2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液，可采用以下方法进行分离。　　Ficoll-Comray分离淋巴细胞法：　　用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液，在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500rpm，离心15分钟。此时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞管中，充分混匀，XXrpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。　　红细胞裂解法　　用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min，后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数　　。应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。　　3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤　　待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。　　加入含有4%多聚甲醛的PBS，4℃反应30min。　　反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。　　再用不含胎牛血清的PBS液洗涤一次，最后用200ulPBS液重悬细胞进行上机检测。　　实验步骤　　1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul.　　2:培养细胞：每个样品设置10个重复孔，其中5个孔加入10ulConA(孔中终浓度5ug/ml),另外5个孔加入10ul培养液，同一般培养条件，培养68h，每孔加MTT溶液　　原理：　　四甲基偶氯唑盐可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。　　材料：　　MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原　　方法：　　1、脾细胞制备：　　小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；　　在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；　　在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5mlHanks液的培养皿中；　　制备脾细胞悬液　　①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min5-10min，(或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(%台盼兰+%Nacl液+细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为5?10/ml。　　②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入5　　离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；　　③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。　　注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。　　2、淋巴细胞增殖反应：　　将5?105/ml脾细胞悬液加入到96孔培