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第二十四章 免疫细胞的分离与检测Separation and Assays for Immunocyte 内容摘要: Separation and Purification of Immunocyte Assays for Lymphocyte Number Assays for Lymphocyte Function Assays for Phagocyte Function 目的要求 掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测； 熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞毒检测的方法； 了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 Ficoll分层液 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll )其密度为1.020。可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞。 （四）淋巴细胞亚群的分离 1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。 2、尼龙柱分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞 3．亲和板结合分离法 4．免疫磁珠分离法 二、B细胞数量检测 mIg检测、CD抗原检测、 FC受体补体受体检测、小鼠红细胞受体检测 （二）T细胞介导的细胞毒试验 1、形态学检查 淋转试验 2、51Cr释放法 3、细胞凋亡检查法 （三）体内试验 皮肤试验 （2）长期保存 在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196℃）中保存。 第二节 淋巴细胞表面标记的检测及亚群类 一、T淋巴细胞表面标记检测 （一）T细胞表面标记 CD2 ： E受体，全部TC和部分NK。 CD3：成熟TC。 CD4：Th/Td细胞，巨噬细胞，HIV受体。 CD8：Tc/Ts细胞，部分NK细胞。 CD25：活化TC，IL-2受体。 CD28：活化TC。 （二）抗体致敏细胞花环法 （三）免疫细胞化学法 （四）免疫荧光法 （五）T细胞亚群检测（流式细胞仪分析技术） 二、B细胞表面标记的检测 （一）B细胞表面标记 B1：IgM、CD5、CD11、CD19、 CD44、MHC-Ⅱ B2：IgM、IgD、CD19、CD23、 MHC-Ⅱ （二）SmIg的检测 （三）B细胞亚群的测定 三、NK细胞表面标记的检测 用流式细胞仪分析技术检测CD3-、CD16+、CD56 + * 第一节 Separation and Purification of Immunocytes 免疫细胞的起源与分化 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞 人体血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 一、外周血单个核细胞的分离 单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞。 分离血细胞常用的分离剂为：Ficoll分层液. Ficoll分层液分离外周血单个核细胞 二、淋巴细胞的纯化与亚群分离 原理：利用单核细胞在37℃和Ca离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。 (一)红细胞的去除 蒸馏水低渗 氯化铵 (二)血小板的去除 离心洗涤 第二节 淋巴细胞的数量检测 一、T细胞数量检测 1、间接荧光免疫法 2、酶免组化法 ABC法 APAAP法 3、微量细胞毒试验 4、花环技术 E花环实验 葡萄球菌花环 抗体致敏花环实验 第三节 淋巴细胞的功能检测 一、T细胞功能检测 （一）T细胞增殖试验 1、形态学检查 淋转试验 2、3H-TdR摻入法 3、MTT比色法 成熟淋巴细胞 转化的淋巴细胞 1、形态学法 放射性测定 3H-TdR 丝裂原（抗原）刺激 淋巴细胞转化试验原理示意 3H-TdR摻入法 二、