RNA干扰技术及应用.pptVIP

本章内容 1 RNAi的发现 2 RNAi 机制 3 siRNA 的设计 4 制备siRNAs的方法 5 RNAi技术的应用 第一节 RNAi的发现 ●ＲＮＡｉ研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组,Rich-orgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现: ●他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中，试图加深花朵的紫颜色，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。 Jorgensen 将这种现象命名为共抑制(cosuppression)因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。 第一节 RNAi的发现 1995年，康乃尔大学的研究人员Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA：特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA：以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 1 RNAi的提出 直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。 2 RNAi广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 2 RNA干扰技术获奖 2001年被《Science》杂志评为十大科学进展之一； 2003年再次被《Science》杂志评为十大科学进展之一； 美国科学家Fire A和Mello C因为发现RNA干扰机制而获得2006年度诺贝尔生理学或医学奖。 4 RNA干扰概念 RNA干扰：是指双链RNA诱导同源m RNA降解从而导致基因表达抑制的现象,又称为基因沉默。 RNA干扰是由双链RNA引起的、广泛存在于动物植物中的转录后序列特异性基因沉默过程, 是生物体在进化过程中抵御病毒感染的保护机制。 利用RNAi的这种特性,可以设计与已知基因 mRNA同源的小干扰RNA(siRNA),导入细胞或动物体内,使特定基因表达沉默, 。 4 RNA干扰概念 体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会导致目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。 第二节 RNAi作用的机制 第一步 起始阶段 第二步 效应阶段 第一步 起始阶段 当dsRNA导入细胞后，被一种称为Dicer的核酸酶(RNA酶Ⅲ家族中一员)特异识别，切割成21-23核苷酸长的双链小片段（small interfering RNA，siRNA）。 Dicer酶能够逐步切割由外源导入或由转基因、病毒感染等各种方式引入细胞的dsRNA。 第二步 效应阶段 双链siRNA与一种核酸酶复合体结合从而形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC) , 每个RISC包含1个siRNA和1个不同于Dicer的RNA酶。 第二步 效应阶段 siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，RISC被活化， 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 第二步（效应阶段） 由RISC中的核酸内切酶作用, 开始对靶mRNA