特异性寡核苷酸探针检测线粒体DNA点突变在线粒体疾病诊断中的应用.pdfVIP

些查查堂堡主兰垡丝苎—— 材料和方法： 15例均为山东大学齐鲁医院神经内科神经病理室病例，其中，单纯型线粒 4例，根据患者的临床、肌肉病理及电镜确诊。 7例，CPEO 体肌病4例，MELAS 血液标本通过随访的方式获得，采用酚／氯仿法提取mtDNA，通过PCR将mtDNA 的突变“热区”——tRNAk“UU耵基因扩增，在下游引物的5’端标记上地高辛， 然后应用反向杂交方法，与点在尼龙膜上的5对寡核苷酸探针(A3243／A3243G、 据杂交信号的显色，确定是否有杂交。同时对杂交结果利用PCR／RFLP方法加以 验证。 结果： 1 其余4例没有A3243G的点突变，也没有其他4个位点的突变，突变的3例中有 2例为母女，从酶切的结果可以明确，突变是异质性的。 (2)临床特点：表现各异，有癫痫发作史者4例，其中1例发作时伴视物 不清；1例表现有痴呆，2例有神经性耳聋，而1例患者则以声嘶、饮水呛咳、 言语不清起病，有共济失调者3例，3例患者有头痛并伴恶心、呕吐，4例患者 全身消瘦明显，另有2例身材矮小，1例有糖尿病。4例有肌无力表现，所有患 者均无肌阵挛。4例病人的颅脑影像学分别显示在左顶、枕叶梗死灶，或大脑半 球大片低密度灶，还可有小脑或脑萎缩的表现。其中例7无症状是另1例患者(例 6)的母亲，而进行了肌活检，也有不整红边纤维。 (3)肌肉病理特点：7例病人不整红边纤维(RRFs)所占比例不等，仅2 染色正常。 2单纯型线粒体肌病组：(1)杂交结果：本组4例病人均未发现以上5个位 点的突变。 (2)临床特点：4例病人均仅表现为程度不同的四肢肌无力及不能耐受运 动，不伴肌阵挛、癫痫、卒中、头痛及视网膜变性，无眼外肌麻痹，无家族史， 无颅脑损害的表现。 (3)肌肉病理特点：4例病例均具有典型的RRFs，COX的缺失比较明显。 2 坐查查堂塑主兰些垒苎一．—— 3CPEO组：(1)杂交结果：本组4例病人均未发现以上5个位点的突交。 (2)临床特点：4例均表现为程度不同的眼睑下垂，2例有眼球运动受限， 2例存在眼底视网膜色素变性，l例伴有颈肌无力、声嘶及肌无力。2例有吞咽 困难，1例出现头痛，1例身材偏小，4例患者均有程度不同的活动易疲劳，全 身无力感，家族史均阴性。 缺失或酶活性降低。 结论： I、PCR／ASO反向杂交技术，适用于已知mtDNA点突变的检测，具有灵敏、 节时、节省开支的优点，并且不同的标本、不同的探针、正常与突变的探针可以 同时杂交，实验结果具有可比性，减少了人为因素造成的伪差，尤其适用于大批 量标本的检测。因此，我们认为PCR／ASO反向杂交技术是快速、可靠的点突变 检铡手段。 2、实验结果显示，3组病例中只有MELAS组的3例检测出3243位点的点 突变，其他病例没有3243位点的突变，也没有另外4个位点的的突变。3例中2 例具有家族史。MELAS组中含有3243点突变患者和无3243点突变患者的临床 及病理表现无明显区别，提示不同mtDNA点突变可导致类似的临床表现型。 其他几例线粒体疾病中未检出包括3243在内的5个较为常见的突变位点，提示 3243点突变是本组线粒体疾病中最常见的点突变类型。 4、我们的临床病理观察结果提示，不同临床类型的线粒体疾病具有不同的 肌肉病理特点。MELAS型患者的COX酶活性可以增强，亦可以减低或完全确 实：而CPEO患者几乎所有gRFs均有COX酶活性缺失，提示不同突变类型可 导致不同的临床和病理表现型。 关键词： 线粒体疾病 单纯型线粒体肌病 MELAS CPE0特异 性寡核苷酸探针 反向杂交 坐奎型堕堂墼翌————————一 DISORDERS MITOCHONDRIAL