突变富集高分辨率熔解曲线分析技术体系的建立以与在循环外周血检测中的运用.pdfVIP

突变富集高分辨率熔解曲线分析技术体系的建立以及在循环外周血检测中的运用 达到对低频体细胞突变基因的检测的要求，且能与HRM技术进行无间断衔接， 以实现一步化基因检测。方法通过检测EGFR、KRAS基因突变建立弹回探针高 分辨率熔解曲线分析技术检测体系，在47例具有测序结果的非小细胞肺癌患者 组织中进行检测体系特异性的验证。在此基础上发明弹回探针突变富集扩增技术 (sP．ARMS)，将突变型与野生型模板按照不同比例混合，经过普通PCR和 SP．ARMS技术的富集扩增后，使用测序技术检测该技术的富集效率。之后结合 弹回探针HRM检测，建立一步快速弹回探针突变富集扩增高分辨率熔解曲线分 析技术(SPA—HRM)体系，并检测其灵敏度。结果经过组织测序鉴定，EGFR基因 19号外显子缺失突变经SP．ARMS技术的富集扩增后，测序可以达到万分之一的 灵敏度：L858R点突变和KRAS基因点突变经SP．ARMS技术的富集扩增后，可以 检测到百分之一的突变。SPA—HRM检测系统在此基础上又将灵敏度提高了10 ARMS，获得了 倍。结论本实验发明了一种富集扩增的技术--Snapbackprimer 高达1000倍的富集效率，是一项高效、简单易行、不需要提高任何检测成本的 HRM技术的结合，实现了千分之一 primer 高效富集扩增方法，随之与Snapback 到万分之一甚至更高的检测灵敏度。 第二部分：在组织、循环外周血中运用弹回探针突变富集扩增高分辨率熔 解曲线分析技术进行EGFR、KRAS基因突变的检测 目的在非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织、循环外周血中运用SPA．HRM技术 进行相关突变检测，与组织测序、ADX-EGFR／KRAS基因检测试剂盒相比，检测系 统的准确性。方法收集NSCLC患者肺癌组织样本150例、其中有85例循环外 周血样本与之相对应。通过引物探针的设计进行E觎R基因exon19缺失突变、 exon21L858R点突变和KRAS基因2号外显子第12、13密码子常见突变的检测。 进行基因组DNA的抽提后，使用SPA．HRM技术检测的同时，使用测序技术和 ADX-EGFR、KRAS基因试剂盒进行双盲检测。鉴定该检测技术的稳定性、准确 性；探论血浆与血清样本对检测结果的影响，选择合适的样本量和样本抽提方式； 结果在85例的NSCLC患者血液样本及相对应的组织样本检测中，测序法基因 论本实验建立起来的SPA．HRM技术可以成功地进行非小细胞肺癌患者循环外 周血中相关基因突变检测，与现下灵敏度最高的ADx．EGFR／KRAS基因检测试剂 盒相比，与组织突变的一致性更高，灵敏性、准确性更好。是一项值得临床推广 运用的一步、快速、低价、准确的组织和外周血DNA检测系统。 关键词：循环外周血DNA；突变富集PCR；EGFR、KRAS基因；低频突变检测； SPA．HRM 万方数据 突变富集高分辨率熔解曲线分析技术体系的建立以及在循环外周血检测中的运用 中图分类号：G305 Abstract thatmutationsin bloodare studieshaveconfirmed circulatingperipheral Many the issues．Astheblood are to and