分子生物学实习报告总结.docx

分子生物学实习报告总结 　　实验总结报告　　摘要　　1、通过PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收得到外源基因parb,进行BglⅡ和XbaI双酶切；抽提质粒pIJ86601，进行BamHI和XbaI双酶切；将两者的酶切产物通过连接转化，培养后抽提质粒进行电泳，测序，检测重组质粒是否构建成功。测序结果显示未构建成功。　　2、用相同的方法构建表达载体PGEX-sco3330，由于时间问题尚未完成。　　3、诱导蛋白表达，蛋白纯化，蛋白脱盐，bradford法进行蛋白含量测定以及SDS电泳和免疫印迹试验。　　实验内容：　　一、构建质粒pIJ86601-parb　　(一)获取外源基因parb　　1.PCR扩增　　PCR体系：200μl体系中，高保真pfuDNA聚合酶10Xbuffer，40μl；10mMMixeddNTP，5μl；PrimerA，5μl；PrimerB，5μl；高保真pfu酶，2μl；DMSO，20μl；双蒸水，120μl；模板1μl。　　PCR程序设定Temp[℃]TimenextturnsGradient[℃]　　1:10min　　2:30S　　3:30S　　4:30S234　　5:10min　　6:1h　　2.　　1)　　2)　　3)　　4)琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块,放入离心管中。按每300μl/100mg的比例加入BindingBuffer,置于50-60℃水浴中10分钟,使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm室温离心2min。取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管,加入500μlWashSolution,12,000rpm室温离心30秒。　　5)　　6)　　7)　　8)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管,加入500μlWashSolution,12,000rpm，静止放置一分钟，室温离心30秒。取下UNIQ-10柱,倒废液,将柱放回同一收集管，12,000rpm室温离心2min。将柱放在一新的EP管中,在柱子膜中央加30μl水，室温或37℃放置2分钟。12,000rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，　　可立即使用或保存于-20℃备用。　　(二)抽提质粒pij86601　　1.挑取适量含质粒pij86601的菌株接种于5ml加有阿伯拉抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时。　　2.取~ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min以沉淀菌种。　　3.倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。　　4.往重悬混和液中加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀7-10次。　　5.往上述混和液中加入350μlsolutionIII，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。　　6.室温下，≥1XXxg离心10min。　　7.将液转移到放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心30秒。　　8.取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管,加入500μlDNAWashBuffer,12，000rpm室温离心15秒。　　9.取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管,加入500μlDNAWashBuffer,12,000rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。　　10.取下UNIQ-10柱,倒废液,将柱放回同一收集管，12,000rpm室温离心2分钟。　　11.将柱放在一新的EP管中,在柱子膜中央加30μlElutionBuffer或水(PH)，室温或42℃放置2分钟。　　12.12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为提取的载体质粒，可立即使用或保存于-20℃备用。　　(三)外源基因与载体连接　　1.对目的基因parb进行BglⅡ和XbaI双酶切，37℃60分钟。酶切体系　　：　　10xBuffer10μl，BglⅡ1μl，XbaI1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。　　2.对载体pij86601进行BamHI和XbaI双酶切，37℃60分钟。酶切体系　　：　　10xBuffer10μl，BamHI1μl，XbaI1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。　　3.用T4ligase对酶切后的目的基因和载体进行16℃连接过夜，连接体系　　：10XBuffer1μl，T4ligase1μl,目的基因7μl，pIJμl。　　(四)重组DNA导入宿主