核酸提取技术(CDC培训).pptVIP

前 言 主要内容 核酸提取的目的意义 核酸提取的一般程序 微生物核酸提取的方法原理 核酸提取质量的鉴定 核酸提取的注意事项 细胞的裂解 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。 细胞裂解后，核酸与大量杂质在一起，必须进行分离纯化。 DNA提取的方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法－流程 质粒DNA－煮沸法 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加1/2体积的氯苯（与多糖的羟基作用去除多糖 ） 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 含有蛋白、多糖、多酚类杂质 有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 有金属离子残留 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对 策 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：DNA降解。 对 策 原因 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜的材料 G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（细菌可增加PK的用量） 延长低温沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 问题三：DNA提取量少 对 策 原因 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放的DNA和RNA在特定pH下分别位于体系的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 影响RNA提取的因素 材料： 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70℃或-20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，-70℃短期保存 影响RNA提取