常用饲用酶制剂检测方法介绍.pptVIP

E. 植酸酶 3.丙酮—磷钼酸铵法 原理：磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后使黄色物质提出来，在355nm波长处测吸光度，灵敏度增加10倍。 特点：钒—钼酸铵法灵敏度最高，丙酮法稳定性最好，抗干扰能力较强。 E. 植酸酶 4. VC—钼蓝法 原理：该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使反应停止，然后加人钼酸铵与VC的混合液，使溶液显色，在820nm波长下测定吸光度，再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程，最后以待测样品吸光度代人方程，计算出酶活性。 影响酶活力的主要因素 A.底物种类和浓度 B.酶活力单位定义 C.酶反应pH值 D.酶反应温度 E.酶反应时间 A.底物种类和浓度 同种方法采用不同底物测定，结果相差很大。 例如木聚糖酶的检测，燕麦木聚糖与桦木木聚糖的测定结果就有明显差距。 底物浓度对酶反应速度的影响图 B. 酶活力单位定义 国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。 酶活计算公式： 酶活性 (U/g) = A × D × 1000 0.2×10×150.13 ×W 其中: A – 比色测定的木糖量，mg/ml； D – 稀释倍数； 1000 –当量换算因数，mmol- umol ； W – 酶样品重量，g； 150.13 – 木糖的分子量，mg/mmol； 10 – 反应时间，分钟。 B. 酶活力单位定义 木聚糖酶的活性定义A：在测定条件下，1秒钟从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量。 酶活计算公式： 酶活（IU）= A × D × 1,000,000 0.2 × 600× 150.13 × W 其中: A – 比色测定的木糖量，mg/ml； D – 稀释倍数； 1,000,000 –当量换算因数，mmol- nmol； W – 酶样品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/mmol。 600 – 反应时间，秒。 C. 酶反应pH值 pH影响酶活力的因素: ①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。影响酶与底物的结合，极度pH的条件引起酶蛋白的变性。 C. 酶反应pH值 最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。 最适pH一般接近在4~8 之间. D. 酶反应温度 温度对酶促反应速度的影响有两个方面： ①提高温度，加快反应速度。 ②提高温度，酶变性失活。 这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。 最适温度就是这两种因素综合作用的结果。 D. 酶反应温度 E. 酶反应时间 酶反应方程式： 随着生成物浓度的增加，酶反应速度减慢，当生成物达到某一浓度，酶反应即停止。 E. 酶反应时间 从图中可以看到，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，由于底物浓度降低，产物反馈抑制，逆反应速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反应速度逐渐下降，最后完全停止。 E. 酶反应时间 在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。 F.激活剂、抑制剂 凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。 激活剂作用包括两种情况：一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。 G.举例 2种木聚糖酶测定方法的比较 测定条件 方法1 方法2 温度 55℃ 50℃ pH 5.3 5.5 缓冲液 0.05M醋酸钠缓冲液 0.1M 醋酸钠缓冲液 反应时间 10min 30min 底物浓度 1％木聚糖 1.2%木聚糖 加酶量 0.2