大学《基因工程》复习归纳重点-复习资料文档.doc

基因工程复习归纳 第一章 绪论 1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。 2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主 基因工程基因工程的历史性事件 1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术 1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市 1988：PCR技术诞生 1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市 2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市 3.基因工程的三大关键元件 基因（供体）：外源基因、目的基因 载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。 宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。 4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色） （1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 （2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 （3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 （4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 （5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 第二章 DNA重组克隆的单元操作 一、用于核酸操作的工具酶 1. 限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。 限制性核酸内切酶的功能与类型 主要特征 I型 II型 III型 功能 限切/修饰 限切 限切/修饰 蛋白结构 异源三聚体 单体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT AACN6GTGC 旋转对称序列 GAGCC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内 距识别序列下游 24-26bp处 其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。 特点：1.识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。2.识别序列为4-6碱基对的回文对称结构（旋转对称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端：5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为37℃,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化（星号反应）。 星活性（star activity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。 引起星活性的因素： ① 高浓度甘油（5%）、② 酶过量（100U/mg）、③ 低离子强度（25mM） ④ 高pH (pH8.0)、⑤ 有机溶剂、⑥ 用其它二价阳离子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。 II型限制性核酸内切酶的命名 具体规则是：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体发现此酶的先后次序。 例子：Eschericha（属名）coli（种名）R （质粒）大肠杆菌R质粒—EcoR I EcoR V Haemophilus（属名） influenzae（种名） d（株名） 嗜血流感杆菌d株-- H i n d II H i n d III。罗马数字表示同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。 特殊性质的II型限制酶：同裂酶，同尾酶 同裂酶：又称异源同序酶或异源同工酶，是指识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶识别相同序列，如HindIII – HsuI: A / AGCTT 同尾酶：是指识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。 2.DNA连接酶（T4-DNA连接酶） 功能：体外连接ＤＮＡ片段 常用的连接酶：Ｔ４ ＤＮＡ连接酶 参与连接反应的基团：３端羟基和５端磷酸基团，形成磷酸二酯键 DNA连接酶的基本性质 ：修复双链DN