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sgRNA 体外转录试剂盒说明书 品名：sgRNA 体外转录试剂盒 货号：PC1380 产品简介： sgRNA 体外转录试剂盒采用T7 RNA 聚合酶复合物高效转录sgRNA 。试剂盒中的反应体系根据 sgRNA 特点进行优化，每个反应可在4 小时内获得多达50 μg 的sgRNA 。sgRNA 纯化后可用Cas9 蛋白体外 切割及细胞注射等实验。 试剂盒中配备了合成sgRNA 转录模板，sgRNA 转录所需的全部试剂，用户仅需要合成含有1 条CRISPR 靶点 的引物就能完成sgRNA 体外转录。 产品规格： PC1380-10 PC1380-50 sgRNA 体外转录试剂盒 (10 次) (50 次) T7 Transcription Enzyme Mix 20 μl 100 μl 5 ×Transcription Buffer 40 μl 200 μl NTP, 25 mM each 80 μl 400 μl Positive control DNA (1 μg/μl) 10 μl 25 μl SG-R primer (10 μM) 100 μl 500 μl PCR template (10 ng/μl) 50 μl 250 μl 2 ×PCR Mix 1 ml 5 ml RNase free H O 1 ml 1 ml 2 3M NaAc pH5.2 150 μl 500 μl 储存条件：-20℃冻存 使用方法： 使用前必读注意事项： 1、 需要自备的试剂及耗材：酚氯仿异戊醇试剂；无水乙醇；70% 乙醇；无RNA 酶枪头、离心管。1:1 水饱 和酚（pH4.7）/氯仿混合溶液（RNA 纯化用）。 2、 务必使用无RNA 酶的枪头、离心管配制转录 反应体系。 实验步骤： 1、制备转录模板 sgRNA 转录模板包括T7 启动子、靶点、sgRNA 序列。具体序列如下： 1.1 设计PCR 正向引物： CRISPR Cas9 识别的靶点为19nt+NGG 共22 个碱基序列，我们以阳性对照的靶点序列为例说明设计引物的方 法。 阳性对照的靶点序列为： 5’-CTGCTAATCCTGTTACCAGTGG-3’ 需要合成的正向引物序列为： 5’-TTAATACGACTCACTATAGGGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’ 010 order@ 1.2 PCR 扩增转录模板 反应体系： 正向引物 （10 μM） 1 μl SG-R primer 1 μl PCR template DNA 0.5 μl 2 ×PCR Mix 25 μl H O to 50 μl 2 每个靶点需同时扩增4 个反应，共计200 μl。充分混匀后放置PCR 仪进行反应。 反应条件： 95℃ 5min 95℃ 30sec 56℃ 30sec 35 cycles