体内药物分析方法的建立与验证体内药物分析课件药物分析研究生复试用重点已标红.ppt

第四章 体内药物分析方法的建立与验证 ;本章内容提要;待测药物与生物介质 体内分析的目的 实验室的设备条件;待测药物与生物介质;一、待测药物的理化性质及体内存在状况;2.待测药物的体内存在状态 ?与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法 ?蛋白结合较强：不宜直接采用溶剂萃取，因萃取率低。 ?体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物与否决定分析检测技术 ?浓度较低（尤其有代谢产物共存） ： 代谢产物的干扰或原型药物与特定代谢产物的同时测定,可采用LC-MS、EIA等分析检测技术;二、分析测定的目的与要求;三、生物样品的类型与样品制备方法;四、实验室条件;第二节 分析方法建立的一般步骤;一、分析方法的选择;分析方法;;二、分析方法的建立;二、分析方法的建立; 取被测组分（药物或代谢产物）、内标物质的标准物质（对照品、标准品或符合标准的原料药）进行试验。 确定最佳检测条件和检测灵敏度（响应值） 色谱条件的确定 ;空白溶剂试验 以水代替生物基质，预处理样品 初步确定合适的预处理条件、考察溶剂的干扰情况、初步了解萃取回收率 空白生物基质试验 采用空白生物基质试验 考察生物基质对测定的干扰（方法专属性） 模拟生物样品试验 待测物加入到空白生物基质中试验 进一步考察生物基质对测定的干扰（方法专属性），确定最佳预处理条件，初步了解生物样品中可测定的最低浓度、方法的准确度、精密度、准确度，药物萃取回收率等。 实际生物样品的测试 预处理方法的最终建立。;第三节 分析方法验证的内容与要求;一、方法特异性(专属性或选择性);考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点： 1内源性物质的干扰 2代谢产物的干扰 3伍用药物的干扰 4与参比方法的相关性;1 内源性物质的干扰;2 代谢产物的干扰;3 伍用药物的干扰;4 与参比方法的相关性;结果比较：Y＝a＋bX 相关系数(r) —— 表示两种方法测得结果的相关性，即呈比例变化的程度，而比例值即为回归方程的斜率b。 在截距a很小的前提下，若斜率b越趋近于1，则??考察方法越等同于参比方法。;二、标准曲线与线性范围;;标准曲线的制备 将药物对照品（溶液）加入与待测样品相同的空白生物基质中混匀，配成已知药浓的标准样品，然后同待测样品一同按相同方法预处理后测定，将分析得到的响应值，对药浓建立标准曲线。 1 加入空白基质的原因： 　使标准样品与待测样品均处于相同的生物基质环境中。 2 按相同方法预处理的原因 待测样品中的组分与标准样品中的组分以相同比例表现为响应值 　3 标准样品中的浓度以单位生物基质中加入对照品量计算，因此药浓为总浓度。　;标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备 内标溶液的制备 标准系列模拟生物样品（标准样品）的制备 标准曲线的绘制 回归方法：加权最小二乘法 ;（1）标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备;;（2）内标溶液的制备;（3） 标准样品的制备;（4）标准曲线的绘制;标准曲线药物浓度表示 以单位体积（质量）生物基质中加入标准物质的量表示。 如：空白血浆0.5ml，加入标准溶液（100ug/ml）10ul（或还有其他溶液） ， 浓度为：2ug/ml。 组织可用ug/g，根据所取匀浆体积所相当的组织重量中加入标准物质的量计算。;（5）加权最小二乘法;（5）加权最小二乘法;（5）加权最小二乘法;2. 标准曲线的限度要求;; 标准曲线 样品测定 空白生物基质 真实样品 +系列浓度对照溶液 +同体积空白溶剂 +内标溶液 +同体积内标溶液 预处理 相同预处理 测定 测定 ;;（三）定量下限（LLOQ）;（四）精密度与准确度;批内(within-run或intra-assay)RSD 　日内(within-day) RSD 　 　在同一分析批（同一日）内的测定结果之间的RSD 批间(between-run或inter-assay)RSD 　日间(between-day，day-to-day) RSD 　 　不同分析批的测定结果之间的RSD 分析批：包括测定样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列，相同实验条件和时间区段。 　一天内可完成几个分析批，一个分析批也可持续几天完成。通常一天完成一个分析批。 ;精密度（precision）;测定方法： 取空白