第二章节 细胞生物学研究探究方法文档.docVIP

第二章 细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 教学目的 1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用； 2、认识工具和方法与学科发展的相关性。 教学内容 本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法: 1．显微成像技术 2．细胞化学技术 3．细胞分选技术 4．细胞工程技术 5．分离技术 6．分子生物学方法 计划学时及安排 本章计划3学时。 教学重点和难点 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。 1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。 2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。 3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。 4．分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离, 应掌握各种分离技术的原理和用途。 本章对分子生物学方法作了简要介绍, 为今后的学习奠定基础。简言之，本章教学重点是仪器方法的基本原理和基本应用；教学难点是电镜制样及分子杂交技术。 教学方法 讲授、参观 教学过程 2.1显微成像技术 2.1.1、光学和电子显微镜成像原理 共同点：照明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统 不同点： ? 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 ? 电子显微镜：以电子束为光源。 表3-1电镜与光镜的比较 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 要求真空 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 玻璃透镜 玻璃透镜 电磁透镜 可见光（400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 200nm 100nm LM FM EM 成像原理 真空 透镜 光源 分辨本领 显微镜 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 2.2.2、常用的光学显微镜 ⑴ 普通光学显微镜 ◆构成： ? ①照明系统 ? ②光学放大系统 ? ③机械装置 ◆原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 ◆分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ? R=0.61λ/n sin(α/2)或者 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为物镜的数值孔径（numerical aperture)，sinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 ? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ ◆显微镜的几个光学特点： ? 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 ? sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ? 普通光线的波长为400-700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。 ⑵ 荧光显微镜(Fluorescence microscope) ? 特点：光源为紫外线，波长较短； 分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 ? 用于观察能激发出荧光的结构。 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 ⑶ 激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM) ? 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 ? 能显示细胞样品的立体结构。 ? 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 ? 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 ⑷ 相差显微镜 ? 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 ①环形光