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血站核酸检测 甘肃省红十字血液中心血站核酸检测的意义 核酸检测（NAT）可以 有效地缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”，从而减少输血风险，提高输血安全。乙型肝炎病毒（HBV）感染检测中，NAT除可缩短HBV感染检测的窗口期外，还可以减少HBV急性感染恢复期、慢性隐匿性HBV感染以及变异病毒株感染的漏检。丙型肝炎病毒（HCV）感染检测中，可将HCV感染检测的窗口期缩短，减少免疫静默感染的漏检。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染检测中，可将HIV感染检测的窗口期缩短。 检测窗口期Window Period核酸研究的历史 1869 米舍尔（Friedrich Miescher） 从脓球分离出细胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名为“核素”(nuclein)。 1944 美国微生物学家埃弗里（O.T. Avery ）等的肺炎球菌转化实验。 1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋Francis Crick 核酸研究的历史 1960年代中期桑格(Sanger)的DNA测序法 1972 伯格(Paul Berg) –重组DNA技术 引起人肿瘤的猴病毒基因与噬菌体lambda的重组 1973 博耶（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重组DNA技术首次得到了重组DNA微生物(基因工程技术) 1983 穆利斯（Kary Mullis) –PCR技术核酸的种类DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA）—— ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA)核酸的分子组成?元素组成 C H O N P （恒定，9~10%）?基本结构单位——核苷酸 磷酸 核苷（戊糖 、碱基）核酸的理化性质核酸分子具有强烈的紫外吸收DNA变性是双链解离为单链的过程 DNA的增色效应 Tm值变性的核酸可以复性或形成杂交双链 复性 退火核酸分子复性和杂交示意图磁珠提取的原理：第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠第二步：结合核酸：pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与 优化试剂中的核酸结合第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来核酸检测基本原理核酸检测：一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，对靶核酸直接扩增或对其附带的信号扩增，使看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号。NAT检测技术方法PCR扩增技术转录介导的扩增方法（TMA 、NASBA）其它NAT技术（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）PCR 原理DNADNATMA的原理Transcription-Mediated Amplification 转录介导的扩增技术模拟DNA 转录成mRNA 的自然过程DNA模板在反应中作为中介利用2个引物和2种酶(RNA聚合酶和逆转录酶）RNA聚合酶与DNA 模板的启动子序列结合等温扩增（41.5℃）逆转录转录翻译TMA的原理特异性靶标捕获特异性捕获探针与病毒核酸分子及内标物杂交结合，并将其固定在磁珠表面。对体系进行重复的洗涤，去除血液样品中除病毒核酸外的其他成分。转录介导的扩增借助逆转录酶和RNA多聚酶的共同作用，在等温条件下，经过一小时的扩增得到约10亿个目标产物片断。双动力学化学发光检测 试剂消除未结合的检测探针，双动力学化学发光检测，分别检测内标与病毒分子信号。理想的核酸扩增实验室设计A理想的核酸扩增实验室设计B核酸扩增检测实验室设计的一般原则?各区独立?注意风向?因地制宜?方便工作关于“区域”合并?如使用扩增和产物分析同时完成的实时荧光PCR仪进行核酸扩增检测，扩增区和产物分析区可以合并。?如使用核酸提取、扩增及产物分析等均在一台仪器上完成的全自动核酸检测分析仪，标本制备区、扩增区和产物分析区可合并。符合基本要求的核酸扩增检测实验室的条件 （1）试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。?（2）各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。?（3）应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排风和有效的装置，以使空气按试剂准备区?标本制备区?扩增（及产物分析）区方向流动。核酸扩增实验室的工作流程 试剂准备区 标本制备区 扩增区及扩增产物分析区试剂贮存准备区 核酸扩增实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性