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几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究 吕玉红 庞礴 苏雅静 刘谊岚 王丽丽 河北科技大学生物科学与工程学院 河北 石家庄 050018 摘要：通过利用λ噬菌体对大肠杆菌烈性侵染特性，研究了宿主生理状态、pH、宿主数量、金属离子及表面活性剂等外界因素对侵染过程的影响，结果表明：宿主生理状态最为重要，指数分裂期的宿主细胞最易受到侵染；pH6～8的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖； 100mg/L钙、镁离子能够促进吸附侵染过程；100mg/L铁离子和0.2%吐温80能够抑制吸附侵染过程。 关键词：噬菌体； 大肠杆菌 ； 宿主；侵染 噬菌体（Bacteriophage）是一类专性寄生的原核生物病毒，分布广泛于土壤、空气、水中或生物体内。根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两大类[1]。噬菌体对发酵工业危害巨大[ 2-4]，本文以λ噬菌体为模式病毒，研究几种外界因素对噬菌体侵染宿主规律的影响。 1 材料和方法 材料 1.1.1 菌种： E.colik12Sgal-（简称负菌）、E.colik12F2gal-/λgal+/λ（简称正菌） 1.1.2　培养基及缓冲溶液 液体肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，pH7.2 上层半固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂0.6 %，pH7.2 下层固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂1.8%，pH7.2 加镁磷酸缓冲液：KH2PO4 2g ,K2HPO4 7g ,MgSO4.7H2O 0.25g ,蒸馏水1000mL 方法 1.2.1 λ噬菌体裂解液的制备[5] 液体肉汤培养基将正菌活化18h，离心收集菌体，缓冲液洗涤，紫外线照射10s～15s，黑暗培养3h，加入0.4mL氯仿剧烈振荡30s～60s，静止5min。离心（4000r/min）15min,上清液分别移入试管中,此液即为λ噬菌体裂解液。再次侵染负菌得到噬菌体富集液。 _________________ 作者简介：吕玉红，女，2003级生物工程专业本科生，大学生创业基金资助。通讯作者：王丽丽教授，电话：0311 E-mail:wanglili@ 1.2.2噬菌体效价的测定 采用双层平板法，将下层固体培养基倒平板凝固为底层平板，液体肉汤培养液将噬菌体裂解液10倍稀释至10-7，5mL融化的上层半固体培养基冷却至45℃左右，分别加入0.5mL负菌敏感菌液，同时加入0.2mL不同稀释度的噬菌体裂解液，迅速倾于底层平板上，轻轻摇匀，待凝固后，置37℃培养24h。统计平板上形成的噬菌斑数量，并计算其效价（噬菌体个数/ml）。 2 结果与分析 正菌菌株是整合λ噬菌体的溶源性大肠杆菌，负菌菌株的λ噬菌体整合能力缺失，因此正菌菌株经紫外线诱导后裂解的λ噬菌体，对负菌菌株则表现为烈性噬菌体的侵染效果。 2.1 紫外诱导大肠杆菌正菌裂解噬菌体的效价 经紫外诱变，正菌被裂解形成的噬菌体裂解液效价为： 2.743×107个/mL 经负菌扩增得到的噬菌体富集液的效价为：1.097×109 个/mL 图1 大肠杆菌的噬菌斑 图1 大肠杆菌的噬菌斑 图1 图1 大肠杆菌的噬菌斑 2.2大肠杆菌的生理状态对噬菌体侵染的影响 噬菌体在固体平板上侵染宿主能够形成基本固定大小的噬菌斑，一般12h左右噬菌斑直径大小不再扩展，说明噬菌体对宿主的侵染是有限制的，这种限制是否与大肠杆菌的生理状态有关？将大肠杆菌负菌接种于液体肉汤培养基中，并等分到8个三角瓶中，37℃摇瓶培养，并每隔2h，取出一瓶接入稀释的噬菌体，,同时无菌培养基接入噬菌体为对照，继续培养到30h，分别稀释后双层平板法观察噬菌体数量，结果见表1。 以对照的噬菌斑结果为阴性结果，则表1显示出前12h噬菌体能够良好侵染宿主，而这个时期正是宿主的快速分裂期，12h后宿主进入稳定期，侵染力也随之丧失，充分说明了噬菌体对宿主的侵染与宿主的生理状态有关，这与固体平板上噬菌斑长到一定大小时不在扩展的结果是一致的。 接入时间/h 2 4 6 8 10 12 14 16 平板上噬菌斑的情况 +++++ +++++ +++ +++ +++ +++ - - 表1 生理状态对噬菌体侵染的影响 注：+++代表噬菌斑数大于300， 2.2 pH对噬菌体侵染的影响 配制不同pH的上层半固体肉汤培养基， 45℃水浴保温，分别加入0.5mL的敏感菌液，同时加入0.2mL的噬菌体稀释裂解液，摇匀后，双层平板观察噬菌斑生长情况。 表2 pH对噬菌体侵染的影响 pH 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 噬菌斑生长情况 - ++ +++