酶化学生物化学.ppt

酶的最适pH不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。 例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 [s]为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 [s]为2.5x10-2 M，最适pH为10.0 三、酶浓度 底物过量下，正比。 用于分离、提纯酶，也是酶活力测定的基础。 [S][E] V∝[E] 四、激活剂（活化剂） 1. 无机离子 （1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。 ① 专一性 ② 有的金属离子可以互相替代 ③ 有的离子间有拮抗作用 （2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等 （3）氢离子 2. 有机分子 3. 具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被一些蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。 （2）EDTA （1）某些还原剂如Cys、GSH等 五、 不同物质对活力降低的机理不同： 1. 失活作用：变性剂使酶空间结构、构象改变。 2. 抑制作用：抑制剂具有一定选择性。 3. 去激活作用：EDTA等金属螯合剂。 抑制作用类型： 1. 非专一性，烷基化、酰基化试剂 专一性：有机汞作解毒剂 DFP 2. （1） 结构似底物 增大底物浓度可消除 A. B. 竞争性抑制作用特征曲线 双倒数曲线 C. 竞争性抑制作用特点 （2） A. 同时在酶的 不同部位作用 B. 非竞争性抑制作用特征曲线 双倒数曲线 C. 非竞争性抑制作用特点 （3） 强弱取决于 抑制剂绝对浓度 与酶-底物中间复合物作用 A. B. 反竞争性抑制作用特征曲线 双倒数曲线 C. 反竞争性抑制作用特点 3、一些重要的抑制剂及其实际意义 （1）不可逆抑制剂：E+I→EI 或 ① 有机磷化合物 化学结构通式: R1、R2 : 烷基 ; X: -F, -CN等 这些有机磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特别是强烈抑制胆碱酯酶。 胆碱 ＋ 乙酸 乙酰胆碱 乙酰胆碱酶 胆碱酯酶 有机磷化合物中常用的是DFP以及有机磷杀虫剂，如1605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。 ② 巯基酶抑制剂 什么是巯基酶？ A、烷化剂：例 ICH2COOH，ICH2CONH2等 B、有机汞、有机砷化合物 C、巯基氧化剂 2E-SH + GSSG E-S-S-E + 2GSH E-S H + I CH2COOH E-S-CH2COOH + HI ③ 金属酶抑制剂 什么是金属酶？ 金属酶抑制剂如氰化物、硫化物和一氧化碳等 。 ④ 重金属抑制剂 如含Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金属盐能使大多数酶失活。 （2）可逆抑制剂 最常见的是竞争性抑制剂 例1：磺胺药中的对一氨基苯磺酰胺 对氨基苯磺酰胺与PABA两者竞争FH2合成酶 例2： 抗癌药物5一氟尿嘧啶 （PABA） 人： 叶酸 （食物） FH2 FH4 叶酸还原酶 细菌： PABA FH2合成酶 FH2 FH4 2.8 酶活力测定 （一）酶的分离提纯 1．选材 2．破碎细胞 3．抽提 4．去核酸、去多糖 5．提纯 6．保存 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1．全部操作在低温0～4℃。 2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 P125 乙醇沉淀 (NH4)2SO4 沉淀 总活力 比活力 蛋白质浓度 酶活力 步骤 总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml) 比活力＝ 酶活力 蛋白质浓度 （二）酶活力的测定 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 1．测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed） （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使[S][E]。 产 物 浓 度 [P] (t) 催化一定化学反应的能力 V大，则酶活力强 2．酶活力和比活力表示方式 （1）酶活力（enzyme activity） 酶活力的定义 酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U） 酶单位的定义 1961年国际酶单位（IU） 1972年Katal（简称Kat）单位 250C，最适pH、底物浓