全血DNA的提取及PCR-RFLP技术的应用.docVIP

全血DNA的提取及PCR-RFLP技术的应用 2014级医学检验技术15班4组 201440045 摘要：以肝素钠抗凝的人全血为材料， 以常规的酚氯仿抽提法为基础， 采用改进的方法提取基因组。结果表明，提取的基因组纯度高，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组主带清晰、无拖尾现象;利用PCR-RFLP技术对人外周全血遗传性疾病的已知突变检测。 关键词：PCR—RFLP；全血；基因组DNA；提取 从外周血中制备高分子量 DNA 是进行分子水平研究的先决条件之一[ 1] 。。不同的DNA提取方法有各自不同的优缺点。目前实时荧光定量PCR技术广泛应用，其定量性能主要取决于样本核酸的提取效率、引物的序列，以及扩增反应的条件。试剂盒法因简便、快速、高效而常被实验室使用，其中主要成分细胞裂解液用量大、单价比较贵，而其他试剂成分又有剩余，弃之可惜。经多次试验并查阅和参考其他资料，我们通过改用O．2％NaCl裂解红细胞收集全血中的白细胞，用5mol／L KI裂解白细胞膜替代试剂盒中的细胞裂解液，再用试剂盒提取基因组DNA，可以获得更多的高质量的基因组DNA，其纯度能满足后续分子生物学实验的需要，是一种适于临床检测及分子生物试验，安全无毒、经济、快速有效的提取基因组DNA的方法。 材料与方法 1 全血样品 利用眼眶取血的方法, 取人外周全血血液1 ml ,以肝素钠抗凝。 2 全血DNA提取方法 (1)离WBC 取1ml 全血，等体积3%明胶，颠倒混匀2-3min，37℃静置，5-10min，取上清(新管），4000r/min 离心 ，5min，弃上清。 (2)破碎WBC 加入2ml TES ，轻轻敲击管底震荡混匀，加10滴10%SDS，颠倒混匀 (3)抽提DNA 加等体积Tris饱和酚，颠倒混匀，100次， 4000rpm，离心5min取上清，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，100次4000rpm，离心5min，将上清移入5ml试管 (4)沉 淀DNA 加2.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀，至有絮状沉淀产生，吸出絮状沉淀到1.5mlEP管，开盖通风橱内放置5min，挥干至，无残余液体，加入100μ? ddH2O溶解 3、PCR扩增 PCR反应体系如下： RFLP方法 用MspⅠ酶对PCR产物进行酶切分析, DNA 进行扩增， 反应体系为 20μl ：10×Buffer 2μl；MgCl2(25mM)2μl；dNTP(2mM)2μl；引 物ITS1、ITS4[5](10μM)各1μl； TaqDNA聚合酶(1U/1μl)1μl；DNA模板1μl； 去离子水10μl。反应条件 ：94℃预变性 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s，35 个循环 ；72℃延伸 10min。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 操作步骤如下 ⑴ 制胶：准备好用于灌胶的玻璃板和间隔条，按照说明安装好制胶架，然后按照下表灌胶 ⑵ 倒胶 将胶灌于两槽之间，立即插入梳子（勿使梳齿下有气泡），室温下凝胶后，垂直拔出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。 (3)装槽 约30分钟后，胶凝固，可装配电泳槽，待上样 (4)上样 酶切产物直接上样（不用加溴酚蓝） （5）电泳 1×TAE为电泳缓冲液，130V，电泳1h 5、银染 操作步骤如下： 10%乙醇固定5min，1%硝酸氧化3mi；ddH2O洗凝胶1min；0.012mol/L AgNO3溶液，20min；ddH2O洗凝胶1min；0.28mol/L NaCO3，0.019% 甲醛显色；10%冰乙酸 2min，停止还原反应；ddH2O洗凝胶2min以上。 结果 本次结果为：野生纯合型（第7条带） 讨论 分子生物学中提取 DNA 的标本种类很多[ 6 ～ 10] ,本组采用的是外周血白细胞细胞核中的核蛋白提取DNA 。制备 DNA 的原则是既要将蛋白质脂质 、多糖及小分 子杂 质分 离干 净 , 又 要得 到高 分子 量的DNA[ 1] 。最早的经典分离方法是 Blin 和 Staffo rd 改良建立的碘酚- 氯法[ 5] ,虽然可提取高分子量的 DNA ,但由于操作复杂 、时间长 , 所以有学者对其进行改良后 ,使提取 DNA 的操作简化 ,时间缩短(6 ～ 8h), 成为现在普遍采用的微量法[ 3] , 但该法提取 DNA 时间仍然较长。 PCR-RFL 分析方法具有一定特异性， 结果较稳定， 重复性较好，只需要一对引物、一种内切酶即可检测。 参 考 文 献 1 王德宝. 核酸的结构 、功能与合成(下册) . 北京 : 科学出版社 , 1987. 387. 2 Blin N , Brow n P O , Bo tstein D , et al. A gen