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全血DNA的提取及PCR-RFLP技术的应用.docVIP

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全血DNA的提取及PCR-RFLP技术的应用 2014级医学检验技术15班4组 201440045 摘要:以肝素钠抗凝的人全血为材料, 以常规的酚氯仿抽提法为基础, 采用改进的方法提取基因组。结果表明,提取的基因组纯度高,用琼脂糖凝胶电泳检测基因组主带清晰、无拖尾现象;利用PCR-RFLP技术对人外周全血遗传性疾病的已知突变检测。 关键词:PCR—RFLP;全血;基因组DNA;提取 从外周血中制备高分子量 DNA 是进行分子水平研究的先决条件之一[ 1] 。。不同的DNA提取方法有各自不同的优缺点。目前实时荧光定量PCR技术广泛应用,其定量性能主要取决于样本核酸的提取效率、引物的序列,以及扩增反应的条件。试剂盒法因简便、快速、高效而常被实验室使用,其中主要成分细胞裂解液用量大、单价比较贵,而其他试剂成分又有剩余,弃之可惜。经多次试验并查阅和参考其他资料,我们通过改用O.2%NaCl裂解红细胞收集全血中的白细胞,用5mol/L KI裂解白细胞膜替代试剂盒中的细胞裂解液,再用试剂盒提取基因组DNA,可以获得更多的高质量的基因组DNA,其纯度能满足后续分子生物学实验的需要,是一种适于临床检测及分子生物试验,安全无毒、经济、快速有效的提取基因组DNA的方法。 材料与方法 1 全血样品 利用眼眶取血的方法, 取人外周全血血液1 ml ,以肝素钠抗凝。 2 全血DNA提取方法 (1)离WBC 取1ml 全血,等体积3%明胶,颠倒混匀2-3min,37℃静置,5-10min,取上清(新管),4000r/min 离心 ,5min,弃上清。 (2)破碎WBC 加入2ml TES ,轻轻敲击管底震荡混匀,加10滴10%SDS,颠倒混匀 (3)抽提DNA 加等体积Tris饱和酚,颠倒混匀,100次, 4000rpm,离心5min取上清,加等体积氯仿:异戊醇(24:1),颠倒混匀,100次4000rpm,离心5min,将上清移入5ml试管 (4)沉 淀DNA 加2.5倍体积无水乙醇,颠倒混匀,至有絮状沉淀产生,吸出絮状沉淀到1.5mlEP管,开盖通风橱内放置5min,挥干至,无残余液体,加入100μ? ddH2O溶解 3、PCR扩增 PCR反应体系如下: RFLP方法 用MspⅠ酶对PCR产物进行酶切分析, DNA 进行扩增, 反应体系为 20μl :10×Buffer 2μl;MgCl2(25mM)2μl;dNTP(2mM)2μl;引 物ITS1、ITS4[5](10μM)各1μl; TaqDNA聚合酶(1U/1μl)1μl;DNA模板1μl; 去离子水10μl。反应条件 :94℃预变性 5min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃30s,35 个循环 ;72℃延伸 10min。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 操作步骤如下 ⑴ 制胶:准备好用于灌胶的玻璃板和间隔条,按照说明安装好制胶架,然后按照下表灌胶 ⑵ 倒胶 将胶灌于两槽之间,立即插入梳子(勿使梳齿下有气泡),室温下凝胶后,垂直拔出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。 (3)装槽 约30分钟后,胶凝固,可装配电泳槽,待上样 (4)上样 酶切产物直接上样(不用加溴酚蓝) (5)电泳 1×TAE为电泳缓冲液,130V,电泳1h 5、银染 操作步骤如下: 10%乙醇固定5min,1%硝酸氧化3mi;ddH2O洗凝胶1min;0.012mol/L AgNO3溶液,20min;ddH2O洗凝胶1min;0.28mol/L NaCO3,0.019% 甲醛显色;10%冰乙酸 2min,停止还原反应;ddH2O洗凝胶2min以上。 结果 本次结果为:野生纯合型(第7条带) 讨论 分子生物学中提取 DNA 的标本种类很多[ 6 ~ 10] ,本组采用的是外周血白细胞细胞核中的核蛋白提取DNA 。制备 DNA 的原则是既要将蛋白质脂质 、多糖及小分 子杂 质分 离干 净 , 又 要得 到高 分子 量的DNA[ 1] 。最早的经典分离方法是 Blin 和 Staffo rd 改良建立的碘酚- 氯法[ 5] ,虽然可提取高分子量的 DNA ,但由于操作复杂 、时间长 , 所以有学者对其进行改良后 ,使提取 DNA 的操作简化 ,时间缩短(6 ~ 8h), 成为现在普遍采用的微量法[ 3] , 但该法提取 DNA 时间仍然较长。 PCR-RFL 分析方法具有一定特异性, 结果较稳定, 重复性较好,只需要一对引物、一种内切酶即可检测。 参 考 文 献 1 王德宝. 核酸的结构 、功能与合成(下册) . 北京 : 科学出版 社 , 1987. 387. 2 Blin N , Brow n P O , Bo tstein D , et al. A gen

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